细胞增殖论文篇1

【摘要】

干细胞研究是目前国内外科学界关注研究的热点领域，文章回顾了补肾益精中药促进干细胞向成骨细胞、造血细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、肝细胞及生殖细胞等多方面增殖分化的研究，为干细胞的研究提供了新的思路。

【关键词】补肾益精中药干细胞分化

干细胞研究是近些年来国内外科学界关注的热点领域，由于干细胞具有多向分化及自我增殖的能力，故在细胞替代治疗、基因治疗、组织工程等方面具有良好的应用前景。祖国医学认为：肾藏精主生殖，肾主骨生髓化血通于脑，肾精的盛衰决定着人体的生长、发育与生殖。由于肾精在内涵及功能上与干细胞有相似之处，目前相关的大量研究表明，许多补肾益精中药可促进骨髓造血干细胞增殖分化，并可促进成骨细胞、血管内皮细胞、神经细胞、肝细胞及生殖细胞等的再生，故加强补肾益精的研究可望为干细胞开创新的治疗途径。现将补肾益精中药在干细胞研究中的应用进展综述如下。

1肾精与干细胞的相似性

祖国医学认为，精是生命的根源物质，精气藏于肾。《素问·六节脏象论》说：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也。”《素问·金匮真言论》曰：“夫精者，身之本也”。肾中所藏之精可分先天之精与后天之精，其中，人出生之前，在母体中所获得者为先天之精。《灵枢·本神》所说：“生之来，谓之精。”《灵枢·阴阳脉解》说：“两神相搏，合而成形，常先身先，是谓精。”《灵枢·经脉》：“人始生，先成精，精成而脑髓生，骨为干，脉为营，筋为刚，肉为墙，皮肤坚而毛发长。”论述了胚胎的形成、发育的过程，认为精是形成胚胎、构成人形的原始物质。这种先天之精来源于父母的生殖之精-即精子和卵子结合后的受精卵，受精卵作为全能干细胞，是构成胚胎发育的原始物质，在母腹内促使胎儿形成并发育完善，故先天之精在含义上与胚胎干细胞是极为相似的。

此外，精不仅是构成人体的基本物质，也是人体生长发育及各种功能活动的物质基础。出生之后，通过肺吸入之清气，脾胃吸收之水谷精气，不断化生为后天之精。后天之精能推动促进机体的生长、发育和生殖，并调节人体的各种生理功能活动。这种“精”的特点是能化，如《素问·阴阳应象大论》所云：“气归精、精归化”，所谓化就是能化生出身体的各种脏器组织及气血津液等所有成分，故具有再生的信息。因此，从中医学的眼光看，中医所言的“精”与多潜能干细胞在内涵与功能上具有很大的相关性［1］。因此，通过补肾益精治疗，有可能通过促进干细胞的增殖分化能力，从而达到修复再生器官、恢复器官功能细胞的作用。

2补肾益精中药促进骨髓干细胞增殖分化的研究

中医学很早就认识到肾与骨髓关系密切，《黄帝内经》曰：“肾藏精，主骨生髓”“骨者，髓之府”“髓者，骨之充也”“肾生骨髓”。

2.1补肾益精中药促进骨髓干细胞向成骨细胞分化根据补肾益精中药具有生髓壮骨功效的理论，国内许多学者通过大量动物实验与临床实践均发现，补肾类中药能促进骨髓干细胞向成骨细胞的增殖分化。

陈薇等［2］研究发现，中药龟版提取物浸膏洗脱后的组分具有促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用。郑良朴等［3］观察不同浓度的补骨合剂（补肾壮骨汤基础化裁）对体外培养骨髓间充质干细胞（MSCs）分化的影响，发现补骨合剂可以促进MSCs分泌碱性磷酸酶和骨钙素，从而加速MSCs向成骨细胞分化。王和鸣等［4］研究巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响，结果发现，巴戟天水提物及醇提物均能促进含药血清法体外培养的骨髓基质细胞向成骨细胞分化，且巴戟天醇提物的作用强于水提物。曾意荣等［5］观察补肾活血中药（由熟地、杜仲、补骨脂、川牛膝、木瓜、枸杞子、丹参、广木香等组成）含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的作用，结果发现补肾活血中药含药血清能对大鼠MSCs在体外增殖能力有促进作用。马慧萍等［6］将淫羊藿总黄酮（TFE）和含TFE的大鼠血清加入大鼠MSCs培养液中，进行细胞增殖和成骨性分化的分析，结果表明TFE活性代谢产物强烈刺激MSCs的增殖和成骨性分化。肖鲁伟等［7］观察复方右归饮含药血清对胎兔骨髓基质细胞体外培养的增殖及向软骨细胞诱导分化的影响，结果发现，不同浓度右归饮含药血清对培养骨髓基质细胞均显示增殖刺激作用，右归饮含药血清诱导后细胞形态由原先的长梭形、纺锤形逐渐变为圆形、椭圆形，Ⅱ型胶原免疫组化染色显示呈现阳性，表明右归饮可诱导骨髓基质细胞定向分化为软骨细胞。

以上这些研究提示中药可以促进骨髓干细胞向成骨方向分化，从而在治疗骨质疏松症、骨缺损疾病方面，或在骨组织工程研究中具有很大的应用前景。

2.2补肾益精中药促进骨髓造血干/祖细胞的增殖分化精血同源，肾与血液的生成有着极为重要的关系，精血可相互滋生转化，肾中所藏的先天之精不仅可以化生为肾气，也能够化生为血液。《张氏医通》云：“血之源头在乎肾”。张景岳在《景岳全书·血证》亦曰：“血即精之类也”。《侣山堂类辨》：“肾为水脏，主藏精而化血”。故通过补肾固精的中药治疗，有可能起到生髓化血的作用。

国内不少学者根据以上理论开展中医药对骨髓造血干/祖细胞生物学的研究由来已久，通过采用多种骨髓损伤的动物模型进行补肾生髓化血的实验研究，并在治疗血液病、放化疗后骨髓抑制等方面进行了大量相关的临床观察，结果表明，补肾生髓中药有保护骨髓、促进造血的作用。

如张荣华等［8］发现补肾活血方（当归、丹参、仙灵脾、骨碎补等）对免疫介导的再障小鼠骨髓CD45+细胞、骨髓有核细胞有保护作用，其机理可能是补肾活血中药能促进骨髓干细胞的增殖分化。张新华等［9］发现益髓生血灵（含熟地、山萸肉、当归、鸡血藤、砂仁、补骨脂、黄芪、党参、龟版胶及阿胶等）对小鼠骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）和红系集落形成单位（CFU-E）均有促进增殖分化作用。陈志雄等［10］研究活髓片（黄芪、当归、川芎、补骨脂等）对环磷酰胺造模小鼠骨髓DNA影响，发现补肾活血中药方可以促进骨髓细胞由G1期进入S期，保护骨髓和促进骨髓细胞的DNA合成。梁毅等［11］研究发现，活髓片对免疫介导再障小鼠骨髓造血微环境紊乱状态有改善作用，可降低骨髓基质细胞凋亡率，促进培养细胞的血管细胞黏附分子（vascularcelladhesionmolecule，VCAM-1）的表达，增加骨髓基质细胞的增殖能力。上述诸多研究证实了肾精充足，髓海充盈，则可促进骨髓的造血功能。

2.3补肾益精中药促进心肌细胞及血管内皮细胞的分化有学者对补肾益精中药在心血管系统再生修复方面的应用有所报道，如朱丹燕等［12，13］研究了淫羊藿苷诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用，结果发现，10-7mol/L淫羊藿苷可体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞，分化的心肌细胞经免疫荧光染色后，心脏α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白T呈阳性。血管生成属于中医“血”“脉”理论范畴，“脉为血之府”，现代医学认为来源于骨髓的内皮祖细胞参与胚胎期及出生后血管的新生与修复，与祖国医学“肾主骨藏精、精血同源”理论有相通之处。王蕾等［14］通过免疫组化的方法观察补肾生血药（熟地、山茱萸、黄芪、阿胶等）对老年金黄地鼠子宫组织血管生成因子碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）表达水平的影响，结果表明补肾生血药能够明显改善老龄动物的生理性肾虚症状，且促进局部血管生成。张树成等［15～17］研究补肾生血方(山茱萸、熟地黄、龟甲胶、阿胶、当归等)和补肾调经方(当归、熟地黄、菟丝子、枸杞子、五灵脂等)对老年雌性金黄地鼠（符合老年生理性肾虚症状）的促血管再生作用，发现这两个方药均具促进子宫组织血管生成作用，提示补肾中药具有整体促血管新生作用。并采用自身对照方法，对服用补肾调经中药前后的人治疗前后着床期子宫内膜组织的VEGF、VEGF受体（VEGFR）、bFGF/FGF、血小板衍化生长因子受体-α（PDGFR-α）、表皮生长因子受体（EGFR）进行免疫组化的对比分析，结果发现服用中药后5种血管生成因子的表达强度和阳性细胞率均明显增加，提示中药具有整体促进血管生成的作用，并进而提出“补肾生脉”说。

由上可见，补益肾精治疗可促使骨髓干细胞向成骨细胞分化，并可促进骨髓造血干/祖细胞、心肌细胞、内皮祖细胞等的增殖分化能力，揭示了“肾主骨生髓化血”的科学内涵。

3补肾益精中药促进神经细胞再生

肾主骨生髓，而“脑为髓之海”（《灵枢·海论》），“髓者，以脑为主”（《素问·奇病论》），“人始生，先成精，精成而脑髓生”(《灵枢·经脉》)，所以脑和髓的名称虽然不同，而实际上是同出肾精一源的，肾精是脑髓形成的物质基础，肾精充足则脑髓充盈，人体便精力旺盛，智慧灵活；肾精不足脑髓空虚，导致记忆力、智力下降。《灵枢·海论》曰：“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”补肾益精中药改善记忆力减退、反应迟钝、思维丧失、神志呆钝等症状的功能已被很多实验证实，多种中医脑病如痴呆、中风后遗症、小儿脑瘫、儿童智力低下、脑萎缩等均表现出脑髓虚损的证候，由于肾精亏损是直接原因，故均可从肾论治，通过补肾填精、充髓益智以治本［18］。

国内有不少学者根据祖国医学“肾藏精生髓通脑”的理论，开展了补肾益精中药诱导骨髓干细胞向神经细胞分化的研究，如张进等［19］观察发现龟版水煎液可体外诱导分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞转分化为神经干细胞，但未能被诱导为神经元样细胞与星形胶质细胞。陈东风等［20］观察龟版含药血清体外诱导成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力，结果发现成年大鼠骨髓间充质干细胞受龟版血清诱导后神经元样细胞NF表达阳性，且阳性表达达到高峰，故认为补肾中药龟版可减轻神经损伤症状，并对局灶性脑缺血后神经干细胞有促进增殖作用。高唱等［21］研究左归丸（主要成分为熟地黄、怀山药、枸杞子、山茱萸、菟丝子、牛膝、鹿角胶、龟版胶等）对分离培养乳鼠神经干细胞增殖分化的作用，发现左归丸可部分拮抗左旋单钠谷氨酸对神经干细胞的抑制作用，显著增加Nestin阳性细胞的比率。蔡光先等［22］探讨地黄多糖对骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的诱导效应，地黄多糖组经地黄多糖诱导培养24h后细胞显示为典型的神经细胞样形态，神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显高于β-巯基乙醇组，而对照组神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白染色均为阴性。因此认为，地黄多糖具有诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的作用。

故目前的研究结果表明，补益肾精治疗可促使骨髓干细胞向神经样细胞分化，揭示出“肾藏精生髓通脑”的科学内涵。

4补肾益精中药促进肝细胞再生

祖国医学历来有“肝肾同源”之说，《素问·阴阳应象大论》云：“肾生骨髓，髓生肝”，生理上，肝肾同居下焦。肝血肾精同化于水谷精微，肾精可以化生肝血，肝血可以化养肾精。病理上亦会相互影响，肾精亏损，最易导致肝血不足；肝血不足，也可引起肾精亏损。

国内李瀚旻等［23，24］根据该理论采用骨髓形成肝细胞动物模型对比观察左归丸对实验小鼠骨髓形成肝细胞的影响，结果发现左归丸能够促进骨髓形成肝细胞，并认为，补肾促进骨髓形成肝细胞的作用机制可能在于调节全身机能和改善肝脏微环境，有利于骨髓细胞移行至肝脏并转化为肝细胞。他们以左归丸治疗经左旋谷氨酸单钠皮下注射结合肝大部切除复制肝肾精血亏虚证动物模型后，结果发现，左归丸在改善模型动物肝再生过程的同时，还可促进模型动物骨髓有核细胞增生，升高外周血红细胞和血红蛋白。卓勤等［25］观察了补肾益精药物益肾宝及左归饮对老年小鼠肝细胞DNA双链结构及损伤修复能力的影响，结果发现，老年小鼠肝细胞DNA的融解温度（Tm）及热增色效应较青年小鼠显著升高，服用补肾益精药物后其Tm及热增色效应明显降低，表明补肾益精药物可以减少老年小鼠肝DNA损伤程度，提高其损伤修复能力，改善其DNA结构的增龄性变化。

由上可见，补肾益精中药具有促进肝细胞再生的作用，上述研究证实了中医学肾与肝的密切联系。

5补肾益精中药促进生殖细胞再生

肾主生殖，天癸是由肾精产生的精微物质，具生殖功能。《类经》云：“天癸者，……人之既生，则此气化于吾身，是为后天之元气。第气之初生，真阴甚微及其既盛，精血乃旺。故女必二七，男必二八而后天癸至，天癸既至，在女子则月事以时下，在男子则精气溢泻，盖必阴气足而后精血化耳。”天癸，在女子为血，男子则为精，其源头在肾。通过补益肾精治疗，可起到调节改善人体生殖功能的作用。

张树成等［26］观察两例放疗后致无精子不育的精原细胞瘤病例，予服用补肾生精中药治疗后（含菟丝子、女贞子、五味子、韭菜子、生地、首乌、党参、白花蛇舌草、蜈蚣、水蛭等），发现患者由无精、偶见精子到具有接近正常的精液质量表现，故提出中药在明确的生精作用中可能具有尚未引起重视的对生精干细胞的直接作用，首次提出中药对生精干细胞可能具有诱导或促分化的作用。

6结语

传统中医学认为，人是有机的整体，天人合一、顺应自然，强调整体观念，只要顺应人体生命规律，自然地充分发挥机体固有机能，就有可能再生修复到病损以前的状态。肾中所藏精气，是生命的基础与动力，是脏腑阴阳的根本，只有肾精充足，才能维持各种正常的生理活动。“精气夺则虚”，肾精亏虚可导致脏腑功能的不足，故可采取“虚者补之”“损者益之”“形不足者，温之以气，精不足者，补之以味”等方法，通过补肾益精法扶持调整脏腑本来具有的机能，同时也启发或者刺激脏腑潜在机能的一面。这种重视人体先后天精气、利用人体自身内在的再生修复能力、通过“扶正”而“祛邪”的中医学理论与目前利用干细胞达到再生修复作用的方法是相通的，且更为简便易行。

通过上述研究的结果，我们相信，随着干细胞研究方法的不断改进和对中医肾精理论认识的不断深入，将会进一步促进补肾益精中药干预干细胞分化的研究，并具有重要的临床意义和广阔的应用前景。参考文献

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细胞增殖论文篇2

【关键词】Survivin基因；,,增殖性玻璃体视网膜病变；,,增殖膜

摘要：目的：观察Survivin基因在增殖性玻璃体视网膜病变增殖膜中的表达。方法：取已确诊为PVR并行玻璃体切除术患者的PVR增殖膜，标本于术后立即由贮液瓶取至无菌器皿冰温运回，取出增殖膜放入多聚甲醛固定，并常规乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋、制备5μm连续切片，将切片行常规H-E染色，采用Survivin多克隆抗体（抗人及抗兔）行免疫组织化学实验，检测Survivin基因在玻璃体和增殖膜中的表达。结果：Survivin基因在PVR增殖膜中呈阳性表达，且随着PVR临床分级的增高，免疫组织化学染色阳性细胞百分率逐渐升高。结论：认为PVR的形成是由于Survivin基因的异常表达促进了细胞增殖，阐明PVR的形成机制。

关键词：Survivin基因；增殖性玻璃体视网膜病变；增殖膜

ExpressionofSurvivinGeneinPeriretinalMembranesofProliferativeVitreoretinopathy

Abstract：Objective:Tostudytheexpressionofsurvivingeneinperiretinalmembraneofprliferativevitreoretinopathy(PVR).Method:14periretinalmembranesobtainedfrom14casesofPVRwithretinaldetachmentundergoingvitretomywereusedtoexaminetheexpressionofsurvivinggenebySABCmethod.Result:Survivingenewasexpressedin8ofthe14cases.Thereactionsofsurvivingwereobservedinthecytoplasmandextracellularmatrix.Conclusion:Theabnormalexpressionofsurvivinggeneinhibitsapoptosisanditmayparticipateintheprogressionofproliferativevitreoretinopathy.

Keywords：Survivin；Proliferative；Vitreoretinopathy

增殖性玻璃体视网膜病变（proliferativevitreoretinopathy,PVR）是指在裂孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后，由于视网膜色素上皮细胞及神经胶质细胞的增生和收缩，又造成牵拉性视网膜脱离的病变。如不及时治疗，终将导致全视网膜脱离而失明。经过大量的实验和临床研究，已认为PVR属于眼内发生的过度损伤修复反应，这是一个以时相为特征的程序化过程，即经过了炎症期、增生期和瘢痕期，其形成的确切机制尚未完全明了。PVR的病理特征是细胞过度增生［1］。细胞增生与死亡失衡可能是PVR形成的原因。Survivin是一个新发现的凋亡蛋白抑制剂家族成员，广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，但仅在少数正常成人组织中表达［2,3］。Survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子［4］。

1资料和方法

1.1一般资料：2004年7月至2005年6月确诊为孔源性视网膜脱离合并PVR并行玻璃体手术的病人14例。排除外伤性、糖尿病等引起的继发性视网膜脱离和系统性疾病。从玻璃体手术中取视网膜表面增殖膜，标本于术后立即由贮液瓶取至无菌器皿冰温运回，取出增殖膜放入多聚甲醛固定，并常规乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋、制备5μm连续切片，将切片行常规H-E染色，采用Survivin多克隆抗体，行免疫组织化学实验，检测Survivin基因在玻璃体和增殖膜中的表达。

1.2方法：石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O237℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶活性，正常兔血清湿盒内37℃封闭20min；滴加羊抗人survivin多克隆抗体，湿盒内4℃过夜，漂洗；滴加生物素化兔抗山羊IgG，湿盒内37℃，20min，漂洗；滴加SABC复合物，湿盒内37℃，20min，漂洗；DAB显色，显微镜下观察，水洗中止反应；脱水，透明，封片。将已知的乳腺癌切片作为阳性对照，用磷酸缓冲液代替一抗作为隐性对照，以组织切片背景清晰、胞质或胞核染为淡黄至黄棕色者为阳性细胞标志。将阳性细胞按显色强度分为3级：表达弱阳性，即显色强度为淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色；表达强阳性，即多数细胞呈黄至棕黄色染色；表达中度阳性，即显色强度介于弱阳性与强阳性之间。凡显色强度与背景无明显差别者为阴性。

2结果

14例PVR增殖膜标本中，8例阳性，其中2例强阳性，4例中等阳性，2例弱阳性。在PVR增殖膜的细胞中，视网膜色素上皮细胞（retinalpigmentepithelium,RPE）占较大部分，胞体变得长园，形态不规则。另外在增生膜中还见一些上皮细胞样和成纤维细胞样细胞。阳性染色位于膜上大部分细胞的胞质内，为棕黄色。阴性对照组中未见阳性染色。

3讨论

PVR是一种细胞增生过度而凋亡过低的疾病。细胞凋亡是多细胞有机体为控制机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡。Survivin是一个近年来发现的凋亡蛋白抑制剂（inhibitorofapoptoticprotein，IAP）家族成员，广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子，几乎在所有被研究的肿瘤中均呈阳性表达。我们认为PVR虽然不同于肿瘤，但它在眼内局部发病情况与肿瘤的发病机理十分相似，均表现为细胞的过度增生。细胞的过度增生意味着细胞凋亡的减少，基于此，本实验从抑制细胞凋亡的Survivin基因着手，采用免疫组化技术，检测Survivin基因在PVR患者增殖膜中的表达，探讨其在PVR发病机制中的作用。为进一步通过反义核酸技术封闭Survivin基因，抑制玻璃体和视网膜细胞增生，在基因水平治疗PVR提供理论依据。

参考文献：

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细胞增殖论文篇3

关键词：葛根素，成骨细胞，破骨细胞，增殖，分化

葛根素(Puerarin)是葛根中具有异黄酮结构的主要活性成分之一，有研究表明，葛根素具有预防骨质疏松的作用[1]。本文观察了葛根素在成骨-破骨细胞共育体系中对大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响,以评价其对骨代谢的作用。

1材料

1.1动物普通级1日龄Sprange-Dawley(SD)新生大鼠和5日龄SD新生大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：2008B006。

1.2药物葛根素广东省药品检验所批号:180752-200809。

1.3试剂DMEM培养基（GIBCO公司），0.25%胰蛋白酶(Amersco公司)，Ⅱ型胶原酶（Sigma公司），碱性磷酸酶试剂盒(Sigma公司)。

1.4仪器超净工作台(苏州净化设备厂产品)，倒置相差显微镜(Nikon产品)，CO2培养箱(ThermoForma公司产品)，细胞培养板(Costar公司产品)，0.45μm过滤膜(Costar公司产品)，紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。论文格式。

2方法

2.1分离培养OB参照文献[2]。

2.2分离培养OC参照文献[2]。

2.3共育体系的建立

在已制作好并消毒的24孔共育培养板，以3×104个/孔的密度将OB接种到OB培养室内，以3×104个/孔的密度将OC接种到OC培养室内，每20min观察一次OC贴壁情况，同时观察是否有细胞透过半透膜进入OC培养室。

2.4MTT法测定葛根素对OB增殖的影响

取第三代OB以3×104个/孔的密度接种于OB培养室，3h后，将新分离的OC以3×104个/孔接种于OC培养室；24h后换入无血清培养液，待细胞周期同步化后，更换为不同浓度的葛根素培养液。各剂量组的终浓度分别为0.05ug/ml、0.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。每个浓度设6个复孔。分别培养7天，更换无血清的DMEM培养基400ul，同时加入5mg/mL的MTT80ul/孔，置37℃，5%CO2培养箱中孵育4h后，在酶标仪上测OD值，波长为570nm。参比波长为630nm。论文格式。

2.5PNPP法检测葛根素对OBALP活性的影响

取第三代OB以5×104个/孔的密度接种于OB培养室，3h后，将新分离的OC以5×104个/孔接种于OC培养室；待细胞周期同步化后，再分别加入0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml的葛根素，与空白组对照。培养7d后，加入500ul0.1%TritonX-100作用30min,收集细胞裂解液，采用ALP试剂盒检测其活性。

3结果

3.1葛根素对成骨细胞增殖的影响

在共育体系中，成骨细胞在5～100μg/ml的葛根素中培养7d后产生促明显的增殖作用。其中以100μg/ml促增殖作用最强。而0.05μg/ml、0.5μg/ml的葛根素作用无明显差异。见表1。

表1不同浓度的葛根素对OB增殖的影响(X±S，n=6)

细胞增殖论文篇4

【摘要】

目的比较两株胃癌细胞HGC-27与SGC-7901的体外增殖和黏附能力。方法分别培养胃癌细胞HGC-27、SGC-7901，用噻唑蓝（MTT）比色实验和流式细胞术(FCM)比较两种细胞的体外增殖能力；用同质黏附和异质黏附实验比较两种细胞的体外黏附能力。结果MTT比色实验绘制生长曲线显示SGC-7901生长较HCC-27慢；流式细胞术结果表明SGC-7901的增殖活性低于HGC-27（P＜0.05）；黏附实验中SGC-7901同质黏附强于HGC-27，异质黏附弱于HGC-27（P＜0.05）。结论胃癌细胞SGC-7901的体外增殖能力和异质黏附能力低于HGC-27，同质黏附能力高于HGC-27，提示胃癌细胞HGC-27的转移能力可能强于SGC-7901。

【关键词】胃癌细胞；HGC-27；SGC-7901；增殖；黏附

Abstract:ObjectiveTocomparetheproliferationandadhesionbetweentwogastriccancercelllinesinvitro.MethodsHumangastriccancercelllinesHGC-27andSGC-7901werecultured.TheabilitiesofproliferationweremeasuredwithMTTcolorimetricassayandflowcytometry(FCM);Theabilityofadhesionwasdetectedusinghomogeneousarrayandheterogeneousarray.ResultsTheresultofMTTcolorimetricassayshowedthatthecellulargrowthofSGC-7901wassignificantlyslowerthanthatofHGC-27(P＜0.05).TheSPFofHGC-27showedsignificantlyhigherthanthatofSGC-7901（P＜0.05）.HomogeneityadhesionexperimentsuggestedhomogeneityadhesionofHGC-27wassignificantlyweakerthanthatofSGC-7901.AlloplasmadhesionexperimentsindicatedthattheadhesiveactivityofHGC-27wassignificantlystrongerthanthatofSGC-7901.ConclusionForSGC-7901，theabilityofproliferationandhomogeneousadhesionwerelowerthanthatforHGC-27，andtheabilityofheterogeneousadhesioninSGC-7901wasstrongerthanthatinHGC-27.

Keywords:gastriccancercell;HGC-27；SGC-7901；proliferation;

胃癌是消化道高发的恶性肿瘤，发病率和死亡率均位于恶性肿瘤的前列［1］。虽然临床上对胃癌可采取手术、放疗、化疗等综合治疗措施，但很多患者仍死于肿瘤的侵袭及转移。侵袭性与转移能力是癌细胞区别于正常细胞的最基本的特征，也是导致患者肿瘤复发、病情恶化而最终死亡的病理基础，因此侵袭转移是影响胃癌预后的最重要的因素［2-3］。胃癌的转移机制尚不清楚，可能与缺氧、微环境变化等多种因素有关［4-6］。本文选取两株胃癌细胞比较其体外生长和黏附特性，为下一步研究胃癌的转移机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试剂与材料

胃癌细胞HGC-27、SGC-7901均购自中科院上海细胞库。RPMI-1640培养基购自GIBICO公司，标准胎牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶购自Amresco公司，96孔板及24孔培养板均购自COSTAR公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

SGC-7901培养于含10%胎牛血清、50μL·100mL-1青霉素、125μL·100mL-1庆大霉素的RPMI-1640培养液中;HGC-27培养于含10%胎牛血清、50μL·100mL-1青霉素、125μL·100mL-1庆大霉素的MEM培养液中，细胞均置于37℃，5%CO2的孵箱中生长。

1.2.2MTT比色法检测两种细胞的体外增殖能力

两株细胞生长于对数生长期后，分别用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，以1.0×103个·孔-1接种于96孔板中，200μL·孔-1，设4个复孔，37℃，5%CO2培养。分别培养1、2、3、4、5、6d和7d计数细胞。结束培养前4h，每孔加入MTT，孵育4h后终止培养，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，充分震荡混匀10min。在490nm波长的酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，以时间为横轴，吸光度值（OD）为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.2.3流式细胞术检测两种细胞的DNA倍体和细胞周期

对数生长期细胞，分别用0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1×106个·mL-1。以正常人外周血单个核细胞做对照，用流式细胞仪在488nm激发光检测DNA含量，MCYCLE软件分析细胞周期，以S期细胞所占百分比（SPF）表示细胞的增殖活性:SPF=SG0+G1+S+G2+M×100%。

1.2.4同质黏附实验

细胞以12.5×104个·mL-1接种于24孔培养板中，1mL·孔-1，每株细胞设3个复孔，待生长至铺满孔底不留空隙，再在其上加入1.0×105个·mL-1的相应细胞，200μL·孔-1，分别于培养60min和90min后，吸上清，并以生理盐水洗涤未充分黏附的细胞，计数上清和洗涤液中的细胞数，即未黏附的细胞。黏附细胞百分比（%）=（细胞总数-未黏附的细胞）/细胞总数×100%。

1.2.5异质黏附实验

以1.0×105个·mL-1接种于24孔培养板中，200μL·孔-1，每株细胞设3个复孔，培养3h后，吸上清，并以生理盐水洗涤未充分黏附的细胞，计数上清和洗涤液中的细胞数，即未黏附的细胞。黏附的细胞百分比（%）=（细胞总数-未黏附的细胞）/细胞总数×100%。

1.3统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，计量资料两两比较采用两样本对数t检验，检验水平为0.05。

2结果

2.1MTT比色法检测两株细胞的体外增殖能力

用两株细胞连续培养7d的吸光度值绘制生长曲线（图1）。结果显示，SGC-7901的增殖速度较HGC-27慢，二者差异有统计学意义。

2.2流式细胞术检测细胞DNA倍体和细胞周期经流式细胞术检测，两株均为异倍体细胞（图2）。SGC-7901的SPF低于HGC-27，且G0/G1比例高于HGC-27，P＜0.05。见表1。表1流式细胞术测定两株胃癌细胞的周期分布(略)

2.3两株胃癌细胞的同质黏附能力及异质黏附能力比较

两株胃癌细胞在同质黏附介质上分别生长60和90min时，SGC-7901比HGC-27黏附细胞数高，差异有统计学意义（P＜0.05）。两株胃癌细胞在24孔板上生长3h后，SGC-7901比HGC-27的异质黏附能力弱（P＜0.05）。HGC-27和SGC-7901的黏附细胞数见表2。表2两株胃癌细胞黏附能力的比较

细胞种类同质黏附实验细胞数/×103个60min90min异质黏附实验细胞数/×103个HGC-276.97±0.077.71±0.198.98±0.15SGC-79017.67±0.12*8.05±0.05*8.32±0.09*与胃癌细胞HGC-27株比较*P＜0.05

3讨论

肿瘤的恶性程度与其细胞的生物学特性密切相关［7］，恶性程度越高的肿瘤细胞体外生长增殖和迁徙转移能力越强；反之，恶性程度低的肿瘤细胞的体外生长增殖和迁徙转移能力越弱。机体肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞需脱落并侵入基质，这时同质黏附能力下降，运动能力增加；肿瘤细胞到达特定的继发组织或器官时，通过异质黏附作用锚定在血管和周围组织，最终形成转移。

本实验采用了两株胃癌细胞：HGC-27来源于未分化胃黏液腺癌，SGC-7901来源于淋巴结转移的胃腺癌［8］。在MTT比色法检测两种细胞的体外增殖能力的实验中，在连续培养的7d内，两株细胞的数量均逐渐增多，但从第2天开始，HGC-27的增殖速度快于SGC-7901。用流式细胞术检测两株细胞的DNA倍体和细胞周期以比较增殖活性的高低，结果表明两株均为异倍体细胞；SGC-7901的SPF低于HGC-27，且G0/G1比例高于HGC-27，表明SGC-7901的增殖活性低于HGC-27。在同质黏附实验中，不论生长60min还是90min，SGC-7901的同质黏附力高于HGC-27，由于同质黏附能力高低在一定程度上反映了肿瘤细胞脱离肿瘤能力的强弱，故HGC-27比SGC-7901更易从肿瘤细胞团中脱离，从而发生转移。在异质黏附实验中，SGC-7901的异质黏附力低于HGC-27，由于异质黏附能力高低在一定程度上反映了癌症细胞与其他组织、细胞黏附能力的强弱，因此SGC-7901比HGC-27更不易与其他组织、细胞黏附，可能不易发生转移。

本实验从增殖和黏附能力检测了SGC-7901和HGC-27的差异，显示胃癌细胞SGC-7901的体外增殖能力和异质黏附能力低于HGC-27，同质黏附能力高于HGC-27，为下一步研究影响胃癌细胞转移的相关分子机制打下基础。

参考文献

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［6］张磊，王效民.基质细胞与肿瘤发生发展之间的关系［J］.中国癌症杂志，2009，19(10):788-792.

细胞增殖论文篇5

【关键词】胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类

InfluenceofbileacidonproliferationandERKexpressioninhumannormalesophagealepithelialcells

【Abstract】AIM:Toobservetheinfluenceofbileacidoncellproliferationandtheexpressionofextracellularsignalregulatedproteinkinase(ERK)inhumannormalesophagealepithelialcellsinvitro.METHODS:Humannormalesophagealepithelialcellsculturedinvitrowereexposedtomediacontaining6differentkindsofbileacids(250μmol/L)respectivelyfor360min，incomparisonwiththecontrolgroup(innormalmediawithoutbileacid).CellproliferationwasassessedusingMTTandflowcytometry.TheexpressionofphosphorylatedERK1/2proteinwasdeterminedbytheimmunoblottingtechnique.RESULTS:Bileacidexposed(312min)esophagealepithelialcellsexhibitedasignificantincreaseinproliferation，especiallyinSphaseofthecellcycle，andthelevelofphosphorylatedERK1/2protein.Whilethebileacidexposedperiodexceeded20min，esophagealepithelialcellsexhibitedadegressioninproliferationandproportiononSphaseofthecellcycle.CONCLUSION:ThebriefexposureinbileacidincreasestheproliferationinhumannormalesophagealepithelialcellsbyactivatingtheERKpathway.

【Keywords】cholicacid;esophagus/cytology;cellproliferation;extracellularsignalregulatedMAPkinases

【摘要】目的：观察胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响.方法：体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，分别在含有6种不同胆酸（250μmol/L）的培养液中培养3~60min，并设对照（培养液不含胆酸）进行比较.采用MTT法和流式细胞技术测定细胞增殖状态.免疫印迹法测定磷酸化ERK1/2蛋白表达.结果：胆酸的短时间（3~12min）作用使细胞增殖比大于1，S期细胞比率升高，磷酸化ERK1/2蛋白表达增加.当作用时间大于20min时，细胞增殖比和S期细胞比率下降.结论：胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关.

【关键词】胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类

0引言

近年来随着国内外食管反流性疾病的增加，对十二指肠胃食管反流的研究日渐深入.反流物中的胆汁主要由胆酸组成，胆酸在反流性食管炎、Barrett食管以及食管腺癌的发生发展过程中起着重要作用［1］.目前胆酸对食管细胞作用的信号传导机制研究尚少.丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)是细胞内信号转导的重要信号分子，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase，ERK)是MAPK通路的主要途径之一，与细胞的增殖凋亡有关［2］.为了进一步探讨胆汁反流的致病机制，本文首次研究了胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响.

1材料和方法

1.1材料人角朊细胞培养液KSFM（keratinocyteserumfreemedium）及牛垂体提取物（BPE），重组表皮生长因子（rEGF）（Gibco公司）.甘氨胆酸钠(GC)，甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)，牛磺胆酸钠(TC)，牛磺鹅脱氧胆酸钠(TCDC)，胆酸(CA)及脱氧胆酸(DCA)（Sigma公司），分别溶于KSFM制成250μmol/L的胆酸溶液.抗人细胞角蛋白14单克隆抗体（CK14）（上海长岛生物有限公司）.抗磷酸化ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体（美国CST公司）.RIPA细胞裂解试剂盒（上海申能生物科技有限公司）.BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（美国Pierce公司）.

1.2方法

1.2.1细胞培养、鉴定和分组取材于食管癌手术切除的正常食管黏膜组织，进行病理检验，仅选取病理诊断正常的标本进行细胞培养.标本获取经患者同意.标本采用无菌收集，保存于4℃无菌KSFM，4h内进行原代细胞培养，具体操作参照已有的方法［3］.获取的食管上皮细胞于KSFM（无血清培养液，含有BPE和rEGF）中，在37℃，50mL/LCO2条件下培养.第1次传代培养后进行CK14的免疫细胞化学染色鉴定细胞.实验组细胞于无BPE和rEGF的KSFM中同步化培养48h后，分别在6种胆酸溶液中培养3~60min.以正常培养液中培养的细胞为对照组.

1.2.2细胞增殖分析将细胞接种于96孔板，5×103细胞/孔.胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24h，MTT法检测细胞增殖情况.在每孔培养液中直接加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，4h后弃去培养液，用100μL二甲基亚砜裂解细胞.于490nm测定吸光值，计算细胞增殖比，增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值.

1.2.3细胞周期观察将细胞接种于6孔板，5×105细胞/孔.胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤一次.每个样本约106个细胞，加入750mL/L冷乙醇固定4℃保存.以50μg/mL核糖核酸酶和50μg/mL碘化丙啶染色，流式细胞仪（FACSCalibur型，美国BD公司）观察G1，S和G2相的细胞比率，以及细胞凋亡率.

1.2.4磷酸化ERK1/2蛋白水平的测定采用Western免疫印迹法.细胞经胆酸作用3min后，依据RIPA试剂盒说明书提取细胞内总蛋白，BCA法检测蛋白浓度.以50μg蛋白上样进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V恒压电泳约25min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处换120V恒压电泳约1h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部.电转法(110V，3h)将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上，分别与抗磷酸化ERK1/2抗体（1∶1000稀释）、抗ERK1/2抗体（1∶1000稀释）4℃孵育杂交过夜.ECL法检测蛋白条带，X线曝光.凝胶电泳分析系统定量条带相对灰度，以磷酸化ERK/总ERK比值判断结果.

统计学处理：每组实验独立重复3次.实验结果以x±s表示.多组均数比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P

2结果

2.1人正常食管黏膜上皮细胞的生长特性细胞单层贴壁生长，卵圆形.CK14是食管上皮细胞的骨架蛋白，免疫细胞化学染色显示第2代细胞均表达CK14.

2.2人正常食管黏膜上皮细胞在胆酸作用下的形态学变化相差显微镜下（×250）观察发现，对于GC，GCDC，TC，TCDC，CA五个实验组，细胞在胆酸作用（3~60min）前后无明显形态学变化.DCA组当作用时间为3~20min时，细胞在DCA作用前后无明显形态学变化；当作用时间超过40min时，部分细胞出现折光性减低、细胞皱缩.

2.3细胞增殖测定测定结果如图1，GC，GCDC，TC，TCDC，CA五个实验组的增殖比为0.952±0.154~1.344±0.139，增殖比大于1或略小于1，呈增殖趋势.DCA组当作用时间为3~12min时，增殖比为1.114±0.163~1.346±0.170，大于1呈增殖趋势；当作用时间大于20min时，增殖比为0.791±0.108~0.431±0.109，小于1呈凋亡趋势.

2.4细胞周期测定检测结果如表1，当胆酸作用时间为3，12min时，GC，TC，CA，DCA四个实验组的S期细胞比率高于对照组(P＜0.05)，各组间的凋亡率无明显差异.当胆酸作用时间为40min时，GC，TC，CA组的S期细胞比率、凋亡率与对照组相比均无明显差异；但DCA组的S期细胞比率降低，凋亡率明显增加(P＜0.05).

2.5磷酸化ERK1/2的表达如图2所示，当胆酸作用时间为3min时，与对照组相比，各实验组的磷酸化ERK1/2表达增加(P＜0.05).GC作用3min后0，5，15，30min时分别测定磷酸化ERK1/2表达(图3)，GC作用刚刚结束时磷酸化ERK1/2表达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15min以后接近对照组水平.

图16种胆酸作用3~60min对细胞增殖比的影响（略）

表1胆酸作用3，12，40min对S期细胞比率、凋亡率的影响（略）

aP＜0.05vs对照.

图2胆酸作用3min对各组ERK表达的影响（略）

图3GC作用后30min内的ERK表达（略）

3讨论

近年来的研究发现反流性食管炎、Barrett食管均存在细胞增殖提高［4］，就此有学者研究了酸对细胞增殖的影响，发现酸可使体外培养的BE组织［5］和Barrett相关腺癌细胞系(SEG1)的细胞增殖率升高［6］.随后有研究表明，GCDC的短时间作用（20min）也对SEG1细胞具有促增殖效应［7］.这提示反流物可能是通过引起增殖异常导致了食管炎症、肠化、癌变一系列病变的发生.由于人正常食管上皮细胞的原代培养在很长一段时间内存在问题，既往的报道均局限于病理状态下食管细胞的研究.我们通过新近建立起来的人正常食管上皮细胞的原代培养技术［3］，第一次报道了胆酸对人正常食管上皮细胞增殖的影响，以进一步探讨反流性疾病的发病机制.

我们将正常食管上皮细胞分别于4种结合胆酸和2种非结合胆酸中培养3~60min，基于Barrett食管患者的食管抽吸物中的平均胆酸浓度［8］我们选取了250μmol/L的作用浓度.结果显示胆酸的短时间作用提高了人正常食管细胞的增殖.细胞形态的观察发现，GC，GCDC，TC，TCDC，CA五种胆酸作用3~60min前后细胞无明显形态学变化，但DCA作用时间超过40min时，细胞出现折光性减低、细胞皱缩的凋亡改变.细胞增殖测定表明，胆酸的短时间作用（3~12min）使得24h的细胞增殖比大于1，随作用时间延长细胞数有所减少，DCA组减少尤为明显，表明DCA较其他五种胆酸对细胞的毒性作用更大.细胞周期的测定结果进一步证实了上述增殖改变，胆酸作用3，12min时S期细胞比率升高，作用40min时S期细胞比率降低，DCA组降低尤为明显，并伴有凋亡率增加.

上述结果提示胆酸对食管细胞的作用具有一定的时效性，即短时间作用产生促增殖效应，长时间作用引起凋亡改变.临床上食管内的胆汁反流具有间断性、反复性的特点，因此我们认为胆酸引起的增殖凋亡异常对反流性疾病的发病机制具有重要意义.既往对胆酸毒性作用的报道很多，相关作用机制的研究也十分广泛深入，但对胆酸诱导增殖的机制报道尚少.我们从信号转导机制方面研究了ERK通路与胆酸诱导增殖的关系，以进一步探讨胆酸诱导增殖的可能机制.

MAPK通路主要有4条途径，ERK是其中研究得较为彻底的一条通路.ERK在所有的真核细胞中都表达，正常情况下以非活性形式位于胞质，受到理化因素刺激时被激活而转位入胞核，参与了细胞生长、发育、分裂等生理过程，并在细胞增殖、凋亡、恶性转化等病理过程中起重要作用［2］.我们发现胆酸诱导正常食管细胞增殖与ERK表达上调有关.当胆酸作用时间为3min时，与对照组相比，各实验组的磷酸化ERK表达增加，胆酸作用刚刚结束时磷酸化ERK达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15min以后接近对照组水平，表明胆酸对正常食管细胞的促增殖作用可能是通过ERK路径.

我们认为，胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关.由此我们推测胆汁反流可能是通过ERK介导的细胞增殖异常，导致反流性食管炎、Barrett食管乃至腺癌的发生.

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细胞增殖论文篇6

【关键词】卵巢浆液性状囊腺癌；雌二醇；雌激素受体抑制剂ICI182780；细胞凋亡

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】1004-7484（2013）03-0033-04

前言

卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，卵巢上皮性恶性肿瘤占原发卵巢恶性肿瘤的50%-70%，由于缺乏早期诊断手段，其5年生存率为30%～40%，病死率居妇科肿瘤首位【1】。许多研究表明雌激素与上皮性卵巢癌的发生、发展有着密切的关系，雌激素的使用增加了女性患卵巢癌的风险【2-4】，亦会增强卵巢癌细胞迁移的倾向，即增加转移的机率【5】。也有研究表明口服避孕药可以降低卵巢癌发生率和死亡率【6】。但目前关于雌激素在卵巢癌中的作用机制尚不十分清楚。

研究表明，上皮性卵巢癌中广泛存在雌激素受体的高表达【7】，雌激素对体外卵巢癌细胞生长的调控是细胞类型特异性的，其机制可能与细胞内雌激素受体的不同表达有关。同一浓度的E2作用于不同来源的卵巢癌细胞，其作用效果是有差别的，激素受体阳性的癌细胞较阴性的敏感【8】。ICI182780（氟维司群）是一种甾体类选择性雌激素受体调节剂，是ER的特异性拮抗剂，其通过加速ER降解而下调ER，可使癌细胞不进入细胞周期从而对抗雌激素的促增殖作用，ICI182780无雌激素样作用，已成为治疗晚期乳腺癌的新一代有效药物【9】。由此推测，雌激素受体特异性拮抗剂ICI182780，可能对上皮性卵巢癌有一定的治疗效果。

本实验以卵巢浆液性状囊腺癌SKOV3细胞系为研究对象，通过体外实验探讨雌激素及其受体抑制剂在卵巢癌细胞生长中的作用机制，以期为上皮性卵巢癌的临床治疗提供理论依据。

材料与方法

一、材料

（一）主要仪器

1）无菌工作台：TerraUniversalInc，USA

2）二氧化碳培养箱：Heracus，Germany

3）光学显微镜：Olympus，Japan

4）台式高速离心机：Sigma，USA

5）100、1000ul的微量加样器：Brand，USA

6）全自动酶标仪：Bio-rad，USA

7）超速低温离心机：Beckman，USA

8）流式细胞仪：FacsVantagese，USA

9）6、96孔细胞培养板、25cm2培养瓶：大连绿竹科技有限公司

（二）药物及试剂

1.试剂

二甲基亚砜（DMSO）：AMRESCO公司，-20℃保存；

胎牛血清：GIBCO公司，-4℃保存；

Dextran-charcoal-strippedFCS：MultiSer公司，-4℃保存；

DMEM培养基：GIBCO公司，临用前按浓度为10%加入胎牛血清，-4℃保存；

AnnexinV-FITc凋亡测试试剂盒：南京凯基生物制品有限公司，-4℃保存。

2.药物

雌二醇（E2）及其受体抑制剂氟维司群（ICI182780）：美国sigma公司，分子量分别为272.39、606.77，无水乙醇配成0.001mol/L原液，E2在4℃保存，ICI182780常温保存备用。

（三）实验用细胞系

卵巢癌细胞株SKOV3来自人卵巢浆液性状囊腺癌细胞，购于南京凯基公司，大连医科大学附属第一医院中心实验室传代培养。

（四）实验用液的制备：

PBS液：（0.1M，PH7.2-7.4）：PBS粉置于大烧杯，加三蒸水，玻璃棒搅拌均匀，定容至1000ml。调整PH值为7.4后分装至玻璃瓶封口，置高压锅中高压灭菌。灭菌后的PBS液置-4℃冰箱中备用，1月内有效。

MTT溶液的制备（5mg/mL）：称取250mgMTT粉放入小烧杯中，加入40ml已配好的PBS液，搅拌均匀，补足PBS液至50ml，超净台中用0.22um的微孔滤器灭菌，分装。避光-20℃冰箱保存1个月有效。

胰酶的制备（0.25%）：GIBCO公司，称取胰酶粉末0.25g，用PBS液100ml充分溶解，超净台中用0.22um的微孔滤器灭菌，4℃冰箱保存备用。

台盼蓝染液（0.4%）：称取固体台盼蓝（Trypanblue）0.4g，溶于PBS液100ml，过滤固体杂质，封存备用。

二、方法

（一）细胞培养与传代

1.细胞培养

将卵巢癌细胞株SKOV3于DMEM培养液（含10%胎牛血清、1.5mmol/L谷氨酰胺、青链霉素各100IU/ml，PH7.2-7.4），37℃、5%CO2培养箱中培养，每48h更换培养液。将对数生长期细胞冻存备用。实验前将上述细胞用不含phenolred但包含5%dextran-charcoal-strippedFCS的DMEM培养液连续培养5-7天再进行实验（每48h换培养液）【10】。

2.细胞传代

当细胞铺满瓶底80%-90%时传代。取出培养瓶，超净台中，弃培养液，PBS溶液冲洗两遍，加入0.25%的胰酶约1ml，旋转培养瓶使胰酶覆盖细胞层，超净台中静置1-2min，倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆，细胞间隙增大时，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用滴管将细胞吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液移装入离心管中，3000rpm/min离心10min，见细胞沉淀于管底，倒掉培养液（含胰酶），加入DMEM培养液，调整细胞浓度为1×103～1×104个/ml，分装接种到培养瓶，培养箱中继续培养。

（二）实验分组

细胞计数实验分组：细胞对照组，E2组及（E2+ICI）组（药物终浓度为lO-7mol/L、lO-11mol/L）。

MTT实验设计分组为：DMEM培养液空白对照组，细胞对照组，E2组及（E2+ICI）组（药物终浓度为lO-5mol/L、lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L、lO-13mol/L）。

流式细胞仪检测细胞凋亡分组：细胞对照组，E2组及（E2+ICI）组（药物终浓度为lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L）。

（三）实验操作步骤

1.细胞计数法

1）收集含5%dextran-charcoal-strippedFCS的DMEM培养液培养5-7天的SKOV3细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，并调整细胞悬液浓度为1×104个/ml。

2）铺板：用微量加样器将上述单细胞悬液按每孔100ul接种于96孔板中培养（即每孔细胞数约1×103个）。每接种3个孔再次吹打细胞悬液，使每孔的细胞均匀一致的铺于孔底。做好标记后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁。

3）加药：用上述DMEM培养液稀释E2及（E2+ICI182780）至终浓度为lO-7mol/L、lO-11mol/L，细胞贴壁后取出96孔板，镜下观察确定细胞单层均匀贴附在孔底后，超净台中小心弃上清，依次加入100ul的药物，置于培养箱中继续培养（每48h更换含同浓度药物的培养液），每24h进行一次细胞计数，共计数6天，每个浓度每个时间点设4个平行孔；同时设阴性对照组即细胞对照组。

4）细胞染色：取出96孔板，于超净台中，PBS冲洗即要计数的细胞，50ul胰酶消化，加入100ulDMEM终止消化，并吹打成均匀单细胞悬液，取10ul移入EP管中，并加入10ul浓度为0.4%的台盼蓝染液，吹打混匀，室温下染色3-5min（注意时间过长会导致活细胞亦会被染色）。

5）细胞计数：染色过的细胞材料，取10ul细胞悬液于细胞计数板上，加盖玻片后放荧光显微镜下观察：死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。进行活细胞计数[细胞数=计数板四格活细胞总数×（10/4）×104]，每孔计数重复3次，取平均值，共计数6d。重复实验3次。

6）根据计数数值进行统计学分析，并描绘细胞增殖曲线。

2.MTT法

1）单细胞悬液的制备：同上。

2）铺板：同上方法接种于96孔板的60个孔底，为了避免边缘效应，96孔板边缘的36孔加入PBS液。做好标记后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁。

3）加药：同上依次加入100ul终浓度为lO-5mol/L、lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L、lO-13mol/L的E2及（E2+ICI182780），置于培养箱中继续培养24及48小时，每个药物浓度组每个时间点设5个平行孔；同时设对照组，包括细胞对照组和只含有DMEM培养液的空白对照组。

4）加入MTT：在每一时间点取样前，避光加入5mg/ml的MTT液20ul，培养箱中继续培养4h。

5）酶标仪测OD值：终止培养，轻轻弃去上清，每孔加入150ul二甲基亚砜（DMSO），微量振荡器振荡8min，结晶充分溶解后酶标仪测定每孔490nm的吸光值（OD490），重复实验3次。

6）细胞增殖抑制率的计算：抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值*100%【11】。

3.流式细胞术检测细胞凋亡率

1）单细胞悬液的制备同上，并调整细胞浓度为1×105个/ml。

2）铺板：将上述单细胞悬液按每孔2ml接种于6孔板。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。

3）加药：细胞贴壁后，弃原培养液，依次加入2ml终浓度分别为lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L的E2及（E2+ICI182780），置于培养箱中继续培养24及48小时，每个浓度每个时间点设4个平行孔；同时设阴性对照组即细胞对照组。

4）流式细胞仪检测细胞凋亡：取出6孔板，胰酶消化收集细胞（为更准确测得凋亡细胞，原培养液不丢弃），置于离心管中，离心（2000rpm，5min），加入500μlAnnexinVBindingBuffer；再加入5μl的AnnexinV―FITc混匀后，加入5μl的PropidiumIodide，混匀；避光室温反应10分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。（Ex=488nm，Em=530nm）

（四）统计方法：

所得数据采用均数±标准差（±s）表示，利用SPSS16.0软件进行数据处理，进行单因素方差分析，检验水准α=0.05，P

结果

一、细胞计数法结果（见表1及附图2-4）

1）细胞培养24h后，10-11mol/L浓度E2组细胞（1.73×104个/ml）比10-7mol/L浓度E2组（1.06×104个/ml）增殖明显（P0.05）。

2）各组细胞增殖曲线如图2所示，对照组细胞在前4天呈直线上升，第5、6天增殖速度变缓。其余各组与对照组呈同样的增长趋势，但10-7mol/L浓度E2组与对照组比较，细胞增殖明显受抑制，而10-11mol/L浓度E2组细胞增殖较对照组增高，加入同浓度的ICI182780，E2的促进或抑制增殖作用则明显受抑制。

3）10-7mol/L浓度E2组及10-11mol/L浓度E2组的第2、3、4天的细胞计数值，分别与对照组比较，高浓度组抑制细胞增殖，低浓度组促进细胞增殖，均具有统计学意义（P

加入与E2相同浓度的ICI182780后，10-7mol/L浓度组抵消了E2的增殖抑制作用，增殖曲线虽仍低于对照组，但差异无显著统计学意义（P>0.05）；而10-11mol/L浓度组不仅完全抵消了E2的增殖促进作用，还显示了明显的抑制增殖作用，增殖曲线低于对照组，培养2、3、4天时的细胞增殖数均明显低于对照组（>0.05）。

二、MTT法检测结果（如表2所示）

1）当E2浓度在10-7～10-5mol/L的浓度范围内，应用24h后的细胞增殖抑制率是16.9%～25.6%，用药48h后抑制率增加到21.4%～30.3%，且随着时间的延长、浓度的增加，抑制率明显增加，均具有统计学差异（P

加入同浓度的ICI182780时，用药24h后的抑制率是9.7%～17.5%，用药48h后抑制率增加到10.3%～18.4%，与对照组相比，亦有抑制细胞生长的作用（P

2）当E2浓度为10-9mol/L时，24h、48h增殖抑制率分别为1.7%、1.2%，但与对照组无显著差异（P>0.05），加入等浓度ICI182780，与对照组比较，明显抑制了SKOV3细胞的增殖（P

3）当E2浓度为10-13～10-11mol/L时，具有促细胞增殖作用，24h细胞增殖抑制率为-5.6%～-7.3%，48h胞增殖抑制率为-8.9%～-10.7%，10-13mol/L浓度组的促增殖作用有所减弱，但与10-11mol/L无明显统计学差异（P>0.05）。同浓度的ICI182780可以完全抵消E2的促增殖作用，与对照组比较无差异（P>0.05）。

三、流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果（如表3、图5所示）

1）SKOV3细胞在10-7mol/L浓度E2作用24h、48h后的总凋亡率分别为26.11%、17.72%，均明显高于对照组（总凋亡率为6.72%、6.76%），差异有统计学意义（P

加入相同浓度的ICI182780，24h、48h总体凋亡率分别为11.95%、13.87%，与E2组（26.11%、17.72%）相比，具有显著的统计学差异（P

2）当药物浓度在10-11mol/L、10-9mol/L时，E2组SKOV3细胞的总体凋亡率及早期凋亡率与对照组均无明显差异（P>0.05）；加入相同浓度ICI182780作用24h的总凋亡率分别为11.79%、14.79%（早期凋亡率分别为10.38%、12.21%），48h的总凋亡率为10.90%、13.15%（早期凋亡率分别为9.17%、11.43%），均高于对照组及E2组，具有统计学差异（P

3）各组别的机械损伤和晚期凋亡的比例，两两比较，均无统计学意义（P>0.05）。

讨论

一、E2及ICI182780对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

女性体内E2浓度在不同生理时期是不断变化的，青春前期及绝经后期其值为最低，排卵期值为最高值，其范围是1.8*10-11～2.2*10-9mol/L【1】。本实验选择了高低两个药物浓度分别为10-7mol/L、10-11mol/L，进行细胞培养，并描绘细胞增殖曲线。结果提示第2、3、4天细胞计数结果提示10-7mol/L浓度E2抑制SKOV3细胞的增殖，10-11mol/L浓度E2促进细胞增殖；各浓度组加入ICI182780，对抗了E2的促增殖或抑制增殖作用，细胞增殖曲线均低于对照组，提示ICI182780不仅对抗雌二醇的作用，还可能直接抑制细胞增殖的作用，这一点与目前的研究结果相一致【12】。

在此结果基础上，本实验采用MTT法检测不同浓度药物对SKOV3细胞增殖的影响，结果提示高浓度E2抑制SKOV3细胞的生长，E2浓度在10-7～10-5mol/L的浓度范围内，应用24h后的细胞增殖抑制率是16.9%-25.6%，用药48h后抑制率增加到21.4%-30.3%，且随着时间的延长、浓度的增加，抑制率明显增加；当E2浓度为10-9mol/L时，细胞抑制率明显减弱至与对照组相近（P>0.05）；E2浓度为10-13～10-11mol/L时，具有促细胞增殖作用，其中10-13mol/L浓度组的促增殖作用较10-11mol/L浓度组有所减弱，但无明显统计学意义（P>0.05），提示激素可能对癌细胞生长存在剂量依赖作用；加入相同浓度ICI182780后，高浓度组（10-7～10-5mol/L）部分抵消了E2的细胞增殖抑制作用，但仍低于对照组（P

二、E2及ICI182780对人卵巢癌SKOV3细胞抑制增殖的可能机制

细胞凋亡是由多种基因调控的主动死亡过程，是保证人体正常发育、维持机体正常生理过程所必需的。在正常情况下，机体内细胞增殖与细胞凋亡保持着动态的平衡，但如果细胞凋亡及其调控基因发生异常打破了这种动态平衡，将导致多种疾病的发生，尤其会诱发肿瘤的发生【14】，近年来研究表明，许多抗肿瘤药物可通过诱导细胞凋亡来发挥治疗作用，肿瘤细胞凋亡敏感性可能是影响化疗效果的关键因素。因此能否诱导以及诱导凋亡的程度成为评价抗肿瘤药的重要指标之一【15】。

本实验通过AnnexinV-FITc流式细胞术检测人卵巢浆液性状囊腺癌SKOV3细胞凋亡定性分析的同时，测出活细胞、凋亡细胞、继发性坏死细胞和培养操作过程中出现机械损伤细胞的比例，与传统方法相比，更能直观、准确地反映细胞凋亡与药物作用的关系。凋亡分析显示：高浓度的E2能够促进SKOV3细胞凋亡，此时雌激素受体抑制剂ICI182780具有对抗或减弱E2的促凋亡作用；低浓度（10-11mol/L、10-9mol/L）的E2对SKOV3细胞凋亡无明显影响（P

根据相关文献报道，目前认为雌激素对肿瘤细胞的作用机制主要包括：1、雌激素分子进入靶细胞核并与受体染色体DNA结合，影响基因的转录表达进而调节细胞的生理功能；2、雌激素是一种转录调节因子，其通过调节与细胞的生长控制或与癌细胞的转移浸润有关的靶基因起作用，如UO-44、fibinlin1、ezrin【18】等；3、雌激素可以诱导卵巢癌细胞系表达肿瘤生长相关基因，如P53基因蛋白的过表达与较差的化疗反应有关【19】；4、雌激素可与细胞因子在卵巢癌细胞中交互调节，即雌激素可通过非受体转导通路，产生的放大信号通路促进卵巢癌的产生和发展【20】。这些可能是本实验中低浓度E2促进SKOV3细胞增殖的作用机制。

许多体外实验研究了雌激素对卵巢癌细胞增殖的作用，认为不同浓度的雌激素对卵巢癌细胞的增殖有着不同的效果，雌激素对癌细胞存在着剂量依赖效应【21】。李琮宾等【22】研究发现生理浓度范围的E2对肿瘤细胞有着一定程度的促增殖作用，而高于10-7mol/L浓度的E2能够抑制卵巢癌3AO细胞的增殖，且有时间浓度依赖性；其认为，不同浓度E2对肿瘤细胞的增殖的影响是通过不同的信号转导通路引起的，即当药物浓度达一定值时，可通过另外的通路机制影响细胞的增殖。

三、E2及ICI182780对人卵巢浆液性囊腺癌的临床应用价值

随着分子生物学技术的发展，研究发现，雌激素与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关，如乳腺癌、子宫内膜癌等。近年来多项研究表明，雌激素与卵巢癌的发生和发展有着密切的关系，雌激素的作用是通过与其受体结合而实现的。ER有α和β两种亚型，雌激素通过ERα和ERβ在介导卵巢癌发生中起着重要作用，细胞内ERα亚型的表达会保护细胞免于凋亡的发生，ERβ对卵巢癌的作用与ERα相反，其通过直接调节某些特异的启动子或抗增殖能力的基因而抵抗ERα的作用，利于细胞凋亡的发生【23】。李琮宾【22】对卵巢癌3AO、H-8910、SKOV3细胞系进行ER亚型的PCR测定，结果显示：ERβ在此三系细胞中均有表达，但明显低于ERα，ERα在H-8910、SKOV3细胞中高表达，国内外多项体外实验提示，不同浓度的雌激素对不同类型的卵巢癌细胞增殖的影响是有差别的，这种差别决定着癌细胞的生与死以及其速率【24】。

近来临床研究表明，雌激素的使用增加了女性患卵巢癌的风险，亦会增强卵巢癌细胞迁移的倾向，即增加转移的机率。抗雌激素药物包括雌激素受体抑制剂和芳香化酶抑制剂。一直以来，他莫昔芬（雌激素受体抑制剂）是卵巢癌抗雌激素治疗的首选药物。一项Ⅱ期临床试验评价了联合他莫昔芬和吉非替尼（生长因子受体抑制剂）治疗卵巢癌，结果显示并没有改善卵巢癌患者的生存期【25】，目前仍缺少关于卵巢癌的抗雌激素治疗的大样本临床研究。ICI182780（氟维司群）作为一种雌激素受体特异性拮抗剂，不但阻断雌激素的促增殖效应，它本身也能抑制肿瘤细胞的生长，并且与雌激素有协同效应，引起的卵巢癌细胞的凋亡【26】。本文通过体外实验证实，生理浓度范围内E2具有促进细胞增殖的作用，而同浓度ICI182780可以抑制细胞增殖，且能够诱导并促进细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用，与他莫昔芬不同，ICI182780无雌激素样作用，已广泛应用于治疗乳腺癌。本实验为将来应用ICI182780辅助治疗卵巢癌提供一定的理论依据。雌激素受体及各细胞信号传导通路间的调控关系，尚有待于今后进一步的研究。

结论

（1）高浓度雌二醇对SKOV3细胞生长具有明显的抑制作用且具有促凋亡的作用；

（2）低浓度（近生理浓度）雌二醇对肿瘤细胞生长有促增殖的作用；

（3）雌激素受体抑制剂可对抗雌激素的作用，且可能有促进细胞凋亡的作用。

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致谢

谨借本论文完成之际，向三年来给予我殷殷教诲、悉心指导的恩师石红教授致以崇高的敬意和衷心的感谢！导师严谨的工作作风、科学的思维方式、优秀的医疗技术、孜孜不倦的学习态度，犹如一盏明灯指引着我以后的工作道路。

衷心感谢妇产科全体医护人员，在临床实习工作中授予我的宝贵的临床经验和操作技能，在生活中给予的大力支持和无微不至的关怀。

衷心感谢大连医科大学附属一院中心实验室的老师们在实验过程中给予的耐心指导和细心帮助。

感谢所有关心、帮助我的老师和同学们！感谢我家人的理解、鼓励和支持！在我漫长的学习生涯中，他们是我前行的动力、力量的源泉，谨以此文献给他们！