单细胞生物的定义范文篇1

关键词：选择；教法；加强；生物学；概念教学

中图分类号：G427文献标识码：A

文章编号：1992-7711（2013）23-048-1

一、讲述法：直接讲述简单特定概念

概念是由词语表达的，通常也是需要通过词语传递，使他人接受并理解。在初中生物教材中，有些概念相对比较简单，具有特定的内涵和外延。如八下教材中关于基因、染色体、DNA、性状等，八上教材中关于反射、反射弧、激素等的概念。对于这些概念，教师用讲述法直接讲述，做到用词确切，讲解透彻，重点突出，抓住概念最本质的特征，能起到先入为主，事半功倍的效果。例如，学生在学习“相对性状”的概念时，教师根据课本定义直接讲述什么是相对性状，让学生得到如下关于相对性状的准确信息，提醒学生找出此概念中的关键词语“同种生物，同一性状，不同表现形式”；再以人的眼皮、耳垂、卷舌为例让学生举例说明什么是相对性状，辅以相关习题加以辨析。在这一直接讲述的过程中，抽象定义结合具体事例，使学生掌握并理解相对性状，加深对新概念本质属性的认识。

二、直观法：形象展现抽象概念

荀子曰：“耳闻之不如目见之，目见之不如足践之”。教育心理学的研究也表明：人体对于外界信息的获取，83%来自视觉，11%来自听觉，3.5%来自嗅觉，1.5%来自触觉，1%来自味觉。在初中生物学教学中，通过实验、挂图、黑板画、模型、视频等多种传统与现代直观教学手段，来展现微观世界，展示生理过程，让学生通过多感官的配合运动来获取概念，使抽象的概念具体化，增强学生对所学概念的持久记忆和深刻理解。在具体的教学过程中，教师可根据不同的内容，选用不同的直观教学手段。如：采用黑板画的方式详解子房的结构以及双受精的过程，引导学生通过观察来获得关于受精、绿色开花植物双受精的定义以及受精后花各部分变化情况；采用计算机模拟动态展示气孔的开放与关闭过程，获得气孔是气体进出的通道，气体的开放和关闭是由一对保卫细胞控制等概念；采用图片展示方法展示草原生态系统、湿地生态系统等不同生态系统的组成，具体范例中归纳出生态系统的精准定义以及描述概念内涵的重要概念即一个生态系统包括一定区域内所有的植物、动物、微生物和非生物环境；采用实验法让学生观察植物细胞和动物细胞的结构，获取细胞是生物体的结构和功能的基本单位，动物细胞、植物细胞都是由细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体组成。植物细胞相较于动物细胞具有特殊的结构，如细胞壁、液泡等这些上位和下位概念。这些直观手段的课堂应用，在微观、抽象的信息直观化的过程中，促进了学生对概念的全面感知与整体把握。

三、类比法：介绍陌生复杂概念

在生物教学中，将复杂、陌生的概念与学生自身熟知的事物或生活经验进行适当的类比，建立一定的联系，这种基于学生已有知识的联系可以促进学生对复杂新概念认知的内化。例如，在介绍植物分类单位时，用填写通讯地址时要写清楚国家、省份、市、区、街道、小区、门牌号等进行类比，让学生建立起“科学家根据生物之间的相似程度，把生物划分为界、门、纲、目、科、属、种，种是分类的基本单位”的重要概念。再如：在生物体三种不同的结构层次的学习中，把细胞、组织、器官、系统、生物体类比成学生熟悉的的个体，小组、班级、年级、学校，帮助学生建立起：①一些生物是由一个细胞构成，一些生物由多个细胞组成；②多细胞生物体具有一定的结构层次，包括细胞、组织、器官（系统）、生物个体；③绿色开花植物的结构层次是细胞组织器官植物体，人体的结构层次是细胞组织器官系统人体等这些描述概念内涵类的重要概念。

四、比较法：辨别成对并列概念

生物教材中，有一些概念是为了对生物现象进行分类而建立的，这些概念往往并列成对的呈现在教材中，如生物因素、非生物因素，生产者、消费者、分解者，非条件反射、条件反射，先天、后天，胚胎发育、胚后发育，外分泌腺、内分泌腺等等，上述概念往往属于同一类属概念，他们之间存在着明显的差异，这些概念在教材中先后出现，教师应该并列介绍，通过列表比较或者图解差异的方式突出并列概念间所存在的差异，帮助学生区分概念。如：循环系统中关于三种血管的结构特点和生理功能的概念可以通过列表的方式从血管的定义、分布、管壁、管腔、血流速度等几方面加以比较，区分三种血管，获得关于动脉、静脉、毛细血管的概念信息。再如：人类的遗传病教学中，关于直系血亲与旁系血亲概念，则让学生以“自己”为中心，以血缘关系远近为原则，根据课本对于直系血亲与旁系血亲的描述，让学生亲自动手画出一张个人专属世代关系图来定义和区分什么是直系与旁系血亲。对于初中生而言，用图表和表格的方式来比较并列概念，更加能显现出概念间的差异，有助于对成对并列概念的认知。

五、正误法：建立科学概念

科学是一个发展的过程，学生在学习任何概念性知识之前，实际上都已经有了旧概念，这些旧概念是存在于学生头脑中的相对于新概念的已有认知，可能正确，也可能是片面的或者是错误的，它来自于学生日常生活中的经验及正确或错误的认知积累。正确的已有概念有助于对新知的认知，而错误的或者片面的旧概念则是学生学习新概念的绊脚石，会让学生形成错误的思维，阻碍生物学科学概念的形成。

单细胞生物的定义范文篇2

（一）教学内容的地位

《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位――细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。

（二）教学目标

1、知识目标

知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。

识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。

应用有丝分裂过程各时期的特点。

2、能力目标

1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。

2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目DNA含量变化，培养学生的分析能力。

3）情感目标

细胞分裂――运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。

（三）教学重点、难点

1、教学重点

真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。

2、教学难点

真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。

二、教学对象分析

首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。

三、教学时间安排

由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。

四、教法和学法

学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教学中，采用自学法、讨论法和讲授法相结合，以问题贯穿本堂课，激发学生的求知欲，充分利用插图、挂图、坐标图，把抽象、微观的有丝分裂过程，形象、生动的展现在学生眼前，通过学生自己的阅读、比较、归纳获取知识，培养学生的识图能力、分析能力。

五、教学过程

（一）新课引入

回忆第一节学习了细胞的结构和功能，细胞是生命活动的基本单位，但大多数生物是由很多细胞构成，细胞的数目是如何增殖的呢？引入细胞增殖、板书课题（通过简洁地提问，引入新课，激发起学生的求知欲）。

（二）新课学习

1、细胞增殖的方式、意义

提问：细胞以什么方式增殖，真核细胞的分裂方式有几种？哪几种？增殖有何意义？

阅读教材第一、二自然段，并思考提出的问题，在教材中勾划出相关内容。给2分钟时间，抽同学回答并点评。（培养学生的自学能力，语言表达能力）

2、有丝分裂

有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式，用以增加体细胞数量，体细胞进行有丝分裂具有周期性，也就是具有细胞周期引出。

1）细胞周期

细胞周期的概念是什么？请同学阅读教材，并引导学生分析概念，是不是所有在分裂的细胞都有细胞周期？一个细胞周期的起点在哪儿？止点在哪儿？（以问题促进学生思考，培养学生的问题意识，进行探究学习，突破重点）

然后阅读插图2-19有丝分裂细胞周期图，引导学生得出一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期，结合起止点，知道分裂间期在前，分裂期在后，从弧线的长短上得出时间的长短，并用表2-1不同细胞的细胞周期持续时间来反证。追问：各阶段有何特点？对于植物细胞和动物细胞而言，它们是否一样？我们先分析植物细胞有丝分裂的特点引出：

2）植物细胞有丝分裂各时期的特点。

①分裂间期

利用挂图指出间期图例，观察结构，提问是不是间期就是“间歇期”？讲述完成DNA复制和有关蛋白质合成，回忆染色质的主要成分，说明实质是进行染色体复制，但并未分开仍由一个着丝点连在一起，画图：由一个着丝点连着的两结构称为姐妹染色单体，染色体数目不变。

②分裂期

人为地分为了四个时期：前、中、后、末。

前期：比较挂图上间期与前期的区别，学生自由交流。

老师归纳两出现两消失，中期：与前期比较，后期：与中期比较，末期：与后期比较。

依次进行，指导学生重点在于分析染色体的变化，老师用一、二句精炼的话归纳，并在黑板上画出特点（让学生把不易看见的变化与看得见的图结合起来，抓住特点，便于记忆，理解、突破重点、难点）。

然后，老师与学生一起对照挂图来描述变化过程，学生复述（通过重复强化学生记忆过程）。

分裂中染色体和DNA数量变化有何规律？用坐标图来反映，老师建立一个坐标图，引导学生据过程一起分析，得出染色体变化曲线。练习，由学生自己按照上述思路绘DNA变化曲线，抽一位同学到黑板前绘制，其他同学在草稿纸上绘，最后点评。（用坐标图更能直观反映出变化过程，引导学生分析，并知道变化规律的由来，加深对过程的理解，让学生积极参与到获取知识的过程中体验快乐）

（三）小结

指出重难点：细胞周期的概念，各时期的特点。（让学生明确需要掌握的内容）

（四）作业布置

预习动物细胞有丝分裂的过程，思考动物细胞有丝分裂与植物细胞有丝分裂有何异同。

（五）板书设计

第二节细胞增殖

一、细胞增殖方式、意义

二、有丝分裂

1、细胞周期

2、植物细胞有丝分裂过程

①分裂间期：DNA复制，有关蛋白质合成，形成姐妹染色单体

②分裂期有：

前：两出现，两消失

中：着丝点排在赤道极上

单细胞生物的定义范文篇3

1肿瘤免疫中红细胞的作用

1.1促吞噬作用

Forslid等[2]发现C3b致敏的酵母菌，中性粒细胞对其吞噬率为15％，当加入红细胞后，吞噬率增加一倍，红细胞碎片亦有相同作用。作者推测红细胞所含抗氧化剂类物质能保护中性粒细胞吞噬过程中释放的氧自由基对中性粒细胞的自身细胞毒作用，从而促进吞噬。徐瑛等[3]亦证明人红细胞能明显促进外周血多形核白细胞（PMN）吞噬功能，在红细胞存在下对酵母菌的吞噬率增加70％左右，促吞噬作用与红细胞补体1型受体（C3breceptor，CR1）数量不同有关。将肺癌患者的红细胞和淋巴细胞按一定步骤与经血清致敏的癌细胞作用，观察肺癌患者红细胞与淋巴细胞围攻癌细胞情况。结果显示：肺癌患者红细胞与淋巴细胞不仅可各自单独围攻癌细胞，且具有协同抗肿瘤免疫作用，肺癌患者红细胞对淋巴细胞免疫粘附癌细胞的促进作用较正常人降低[4]。徐瑛[3]检测了恶性肿瘤患者红细胞促PMN吞噬能力，发现患者红细胞促吞噬率明显低于正常人，认为癌瘤患者红细胞CR1减少是红细胞促PMN吞噬减弱的原因之一。郭峰等[5]发现红细胞能直接粘附肿瘤细胞，肿瘤细胞经与补体作用后粘附红细胞能力明显增强，并能促进淋巴细胞、粒细胞对肿瘤细胞的粘附，而CR1单克隆抗体能抑制红细胞粘附肿瘤细胞的活性，说明在肿瘤免疫中红细胞有免疫调控，增强其它细胞功能的作用，这种作用是红细胞膜上的CR1介导的。Siegel推测红细胞能阻止癌细胞在血循环中扩散，因为癌细胞在外周血中遇到红细胞的机会比白细胞大1000倍，癌细胞表面覆盖有抗体补体，易被红细胞粘附而被捕捉吞噬。

1.2清除循环免疫复合物

肿瘤产生的大量抗原与血中抗体形成的免疫复合物（IC）被认为是一肿瘤免疫抑制因子，是造成肿瘤免疫逃逸的原因之一。IC沉着于组织某些部位，激活补体系统，亦可造成组织损害。红细胞膜具有CR1，通过CR1，红细胞与抗原－抗体－补体复合物结合，并将其运送至肝脾固定吞噬系统，IC从红细胞上解离，被吞噬细胞吞噬清除，释放IC后的红细胞可再回到血循环中，仍具有结合IC的能力[8]。CR1为分子量205000的糖蛋白，存在于红细胞、B细胞、PMN及单核细胞上，每种细胞所含CR1数量不同，红细胞为950，B细胞为2100，PMN为57000，单核细胞为48000，从数字上看每个红细胞所含CR1数仅为有核细胞的1/20～1/50，但由于血循环中红细胞数为有核细胞数的1000倍，而血循环中95％的CR1是分布于红细胞上的，清除IC主要是红细胞而非白细胞。Medof[6]等的体外试验结果支持上述推测，他们将抗原－抗体－补体的复合物与人血细胞混合孵育，然后测定各类细胞结合复合物的数量，结果发现红细胞结合了82.8％～84.8％的复合物，而中性粒细胞与单核细胞分别结合了8.3％～15.2％和1.6％～5.8％的复合物。最近发现红细胞CR1与有核细胞CR1在功能和结构上不同，红细胞CR1在细胞膜上的分布呈簇性(cluster)。Paccaud等[7]比较了PMN与红细胞结合IC的能力，发现在相同细胞浓度下，PMN结合IC能力与红细胞结合IC能力相同，尽管PMNCR1数量是红细胞CR1数量的4倍，在相同CR1数量条件下，静止的或激活的PMN结合IC的能力始终低于红细胞。电镜下发现红细胞上50％的CR1呈簇性分布，而PMN小于15％，激活的PMN虽CR1数量增加，但簇性CR1的数量并不增加，因而认为PMN的功能是组织吞噬，清除IC为红细胞的功能。

1.3效应细胞样作用

红细胞表面有过氧化物酶，能使红细胞直接销毁粘附的抗原物质，从而起效应细胞样作用。郭峰等[6]发现红细胞能与多种癌细胞发生粘附包括血清致敏的肝癌原代、传代细胞株，鼠淋巴母细胞瘤，艾氏腹水癌细胞，各种肿瘤细胞与红细胞形成花环的百分率平均值大16％～60.97％。电镜下可见红细胞发生变形运动以顺应肿瘤细胞的表面形态，甚至还可发生阿米巴样运动，包绕坏死的肿瘤细胞碎片，粘附处的红细胞膜与肿瘤细胞膜粘附、融合。肿瘤细胞与红细胞结合处有破损现象，在红细胞中可见癌细胞碎片，这种粘附作用可被CR1单抗或C3多抗阻断。

1.4红细胞对淋巴细胞和细胞因子的调控作用

Yannelli[8]等观察了红细胞对LAK细胞杀伤活性的影响，作者采用51Cr释放微量细胞毒法检测了12例癌症患者LAK细胞对Daudi肿瘤细胞的杀伤活性，发现在培养时未用Ficoll－Hypaque液离心除去红细胞者其LAK细胞活性较除去红细胞者增强1～3倍，最大1例达20倍，进一步发现红白细胞比从3～100:1时，溶解瘤细胞活性逐渐增强，在100:1时至少增加2倍，并证明红细胞的增强作用是在LAK细胞培养的诱导期且需要细胞间的接触。因而认为制备LAK细胞时不需要分离除去红细胞，相反加入适量的红细胞对增强LAK细胞毒活性更为有益。

NK细胞(Naturekillercell)在体内担负着重要的免疫监视功能。红细胞能直接增强NK细胞的抗肿瘤活性，Shou等[9]检测了在红细胞存在下NK细胞毒活性，发现红细胞与效应细胞比值为1.3:1时NK细胞毒活性开始增强，在2.5～20:1时增加最明显，不论自体，同种异体或异种红细胞都能使NK细胞活性增强，但破碎的红细胞无增强作用，增强作用可能与NK细胞上补体受体有关。郭峰[6]亦发现，当在效：靶：RBC比为10:1:25的条件下时加RBC组NK细胞活性明显高于未加RBC组。肿瘤患者红细胞对NK细胞活性的正性效应降低。Shou[10]最近发现在RBC的胞浆内存在着一种自然杀伤细胞增强因子(NatureKillerEnhancingFactor,NKEF)能增强NK细胞活性，并对其理化特性做了初步分析，认为RBC在调节NK细胞方面可能起着重要的作用。

Sigfusson等[11]发现，用美州商陆丝原刺激淋巴细胞转化，加自身红细胞可增加淋巴细胞转化率和IgG、IgM、IgA的合成。Virella等[12]进一步实验发现，在培养前红细胞与抗LFA－3单克隆抗体作用或淋巴细胞与抗CD2的单克隆抗体作用后培养时不增加B细胞反应，说明淋巴细胞转化合成抗体与红细胞LFA－3和淋巴细胞CD2相互作用有关。

红细胞能使人T细胞增殖加强，促进T细胞IL－2受体表达以及肿瘤坏死因子[13]和γ－干扰素产生[14]。用PHA刺激人外周血单个核细胞可诱导干扰素产生，Keyes等[14]发现在培养时加入红细胞可使干扰素产量增加4～10倍，干扰素产量随红细胞与淋巴细胞比值关系而变化，最适宜浓度为10～50:1。红细胞的促进作用与血型无关，红细胞碎片亦有相同刺激作用，抗CD2的单克隆抗体可抑制红细胞对T细胞产生干扰素的促进作用。Kalechman等[15]亦发现在培养时加入自身RBC可使人单核细胞或鼠脾细胞对亚适合剂量的丝裂原的反应增强，包括细胞增殖，IL－2、IL－3、IL－6、克隆刺激因子及γ－干扰素的分泌增加，这种增强效应为剂量依赖性的。还发现在无丝裂原存在下RBC能增强人单核细胞及鼠脾细胞IL－2R的表达，这种增强效应与红细胞膜与T细胞上的CD2分子相互作用有关。

2红细胞免疫功能的调控及意义

Siegel等[1]在兔血清中发现了抑制红细胞免疫粘附的因子，该因子为一不耐热物质，58℃30分钟可除去其活性，推测该因子为一大分子物质，机体通过控制该因子的合成来调节红细胞免疫功能。Yin等[16]发现该因子为一种球蛋白，对热不稳定，有与赖氨酸结合的位点，该因子可阻止IC粘附到红细胞上，降低红细胞粘附携带IC的能力。郭峰等[17,18]还发现血清中除存在红细胞免疫抑制因子外，还存在着红细胞免疫粘附促进因子，该因子耐热，58℃不能灭活。在正常人血清中促进因子活性明显大于抑制因子，肿瘤患者抑制因子活性上升，促进因子活性下降，因而认为机体内存在着红细胞免疫正负调节机制，该调节机制紊乱可能是某些疾病发生发展的原因。最近还发现β内啡肽、胸腺素、转移因子[6]等对红细胞免疫功能有促进作用，说明神经内分泌系统、白细胞系统亦参加红细胞免疫功能的调控。临床上已发现肿瘤患者血清中红细胞免疫抑制因子活性增强。

3肿瘤红细胞免疫功能改变

章岳山等[19]发现，近交系615小鼠在接种可移植性组织细胞淋巴瘤LII后，小鼠红细胞免疫功能随着肿瘤的发展呈下降趋势，在肿瘤侵袭早期和中期下降最为迅速，而肿瘤转移开始至肿瘤转移晚期以后，其下降速度减慢，认为这一改变可作为评估肿瘤发展程度的参考指标之一。

Currie等[20]采用抗CR1单克隆抗体检测肿瘤患者红细胞CR1受体数，发现在Hodgkins病、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和淋巴瘤，其CR1受体数较正常人减少将近一半，而在缓解期均有不同程度的恢复，因而认为红细胞CR1减少为获得性的，对红细胞CR1检测可能对判定肿瘤患者病情转归有意义。已发现在乳腺、胃、大肠、肝、卵巢、血液系统等多种肿瘤患者CR1活性降低。红细胞CR1减少，一方面使红细胞对肿瘤细胞的调理促吞噬作用功能降低，另一方面导致IC清除障碍，循环中IC增高。在肿瘤患者血清中存在着促进肿瘤生长的因子，称封闭因子，目前认为该因子为肿瘤抗原与抗体形成的免疫复合物，IC增高加重破坏了宿主抗肿瘤免疫能力，造成恶性循环，肿瘤细胞逃逸宿主免疫系统的攻击得以生长繁殖。

Siegel[1]推测红细胞能阻止癌细胞在血循环中的扩散，但缺乏证据。郭峰等[6]证明红细胞与癌细胞能发生粘附，在艾氏腹水癌腹水中发现了红细胞包绕癌细胞形成花环的现象即为一例证，从而在形态学上有力地支持了Siegel[1]的这一推测，更重要的是红细胞与癌细胞发生粘附后除可促进吞噬细胞吞噬外，红细胞本身还表现出效应细胞样作用，这一新发现对探讨红细胞在肿瘤免疫中的作用很有意义。已发现荷瘤小鼠红细胞粘附肿瘤细胞能力明显低于正常鼠；临床上，已发现在乳腺癌、胃癌、食管癌等患者，红细胞粘附肿瘤细胞能力降低，同时还发现在消化道癌患者肿瘤红细胞花环率高低于手术后证实肿瘤发生转移与否有相关性，手术切除肿瘤可使患者的红细胞免疫功能改善。因而，检测红细胞免疫功能可能对判断肿瘤转移，疗效估计及预后有一定价值。Niehans等[21]最近在多种癌细胞上检测到补体抑制蛋白CD46(MCP)，CD55(DAF)及CD59(Protectin)的表达，CD46可协助I因子加速对C3b的灭活，避免C3b沉积在癌细胞表面，从而使红细胞不能通过其CR1受体与癌细胞发生免疫粘附，这可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。

红细胞免疫功能提出至今已取得了很大进展，但许多问题尚待澄清。肿瘤患者红细胞CR1减少是肿瘤发展过程产生的还是引起肿瘤的原因之一？抑制因子及促进因子的来源性质，相互作用机制及在肿瘤发病中的作用，红细胞粘附肿瘤细胞的意义等仍需做进一步的研究。另外能否通过药物调节红细胞免疫功能来治疗某些疾病亦是今后需进一步研究的方向。

作者单位：蔡小勇林进令广西医科大学第一附属医院外二科(南宁市530027）

文明星湖南医科大学第二附属医院

参考文献

1SiegelI,LiuTL,GieicherN.Thered－cellimmunesystem.LanCET,1981;II(8246):556

2ForslidJ,HedJ,StendahlO.ErythrocyteenhancementofC3b－mediatedphagocytosisinhumanneutrophilsinvitro:AcombinedeffectoftheerythrocytecomplementreceptorCR1anderythrocytescavengerstoreactiveoxygenmetabolites.Immunology,1985;55(1):97

3徐瑛，郭峰，叶天星.红细胞增强中性粒细胞吞噬作用及红细胞过氧化物岐化酶的临床意义.上海医学,1990;13(6):346

4张贺龙，唐敏章.肺癌患者红细胞与淋巴细胞的协同抗肿瘤作用.中国肿瘤临床，1994;21(12):898

5郭峰，黄盛东，赫丽，等.红细胞在肿瘤免疫中的作用.中华微生物学和免疫学杂志，1995;15(3):183

6MedofME,OgerJJF.Competitionforimmunecomplexesbyredcellsinhumanblood.JClinLabImmunol,1982;7(1):7

7PaccaudJP,CarpentierJL,SchifferliJA.Differenceintheclusteringofcomplementreceptortype1(CR1)onpolymorphonuclearleukocytesanderythrocytes:effectonimmuneadherence.EurJImmunol,1990;20(2):283

8Yannelli,JR,ThurmanGB,Mrowca－BastinA,etal.Enhancementofhumanlymphokineactivatedkillercellcytolysisandamethodforincreasinglymphokine－activatedkillercellyieldstocancerpatients.CancerRes,1988;48(20):5696

单细胞生物的定义范文篇4

【关键词】麦绿素；免疫作用

麦绿素就是大麦嫩苗的汁液，选用生长期45d左右，苗高25～28cm的鲜大麦麦苗，用高科技方法提取、精制成粉，通过消毒、杀菌、包装即成麦绿素粉。东西方科学家均称之为“植物的奇迹”，“上帝赐予人类的礼物”。据研究，麦嫩苗汁液是世界上单项资源中营养物质含量最丰富、最均衡、最适合人体细胞需要的保健品资源，是营养细胞、修复细胞创伤的最佳选择。它是科学家花费十多年时间从几百种植物中挑选出来的。小麦、大麦嫩叶中富含麦绿素、酵素、天然维生素、矿物质及氨基酸等成分，由于采用高科技工艺，其营养物质的活性不容易丧失，以活性状态保存了麦嫩苗中的蛋白质（含有人体必需的全部18种氨基酸）、多种天然维生素（其中包括相当丰富的胡萝卜素）、微量元素（其中包括极丰富的钾离子）、大量对人体有益的酶（包括SOD酶），天然叶绿素含量是胡萝卜的13倍，维生素含量是苹果的65倍，铁含量是菠菜的5倍，钙含量是牛奶的11倍，钾含量是香蕉的25倍[1]。但是，长期服用是否能够改善人的身体素质和增强机体的免疫力，国内相关报道较少，为此我们进行了实验研究。

1材料与方法

1．1样品麦绿素为杭州博可生物科技有限公司提供。受试样品以蒸馏水配制成试验所需的浓度。

1．2动物实验雄性昆明种小鼠，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。将小鼠随机分为阴性对照组及低、中、高三个剂量组，分别给予0．3g、0．6g、1．2g/（kg・d）（分别相当于人体推荐摄入量的5、10、20倍）。所有实验动物均食用全价营养配合饲料，自由摄食饮水。

1．3仪器MA110型电子天平（上海第二天平仪器厂），ARS型电子秤（杭州电子秤有限公司），OLYMPUS光学显微镜，722型分光光度计（上海绿宇生物科技有限公司）。

1．4实验方法按卫生部的《保健食品功能学评价程序和检验方法规范》[2]中增强免疫力功能检验方法进行。给予受试物的灌胃体积为20ml/kg,1次/d，连续30d。测定的项目有：①体质量、胸腺/体质量比值、脾脏/体质量比值；②细胞免疫功能测定：ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）、二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应（耳廓肿胀法）；③体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）、血清溶血素测定（血凝法）；④单核-巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法）；⑤NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶测定法）。

1．5数据统计处理方法采用SAS6．12统计软件对数据进行方差分析和Dunnett’st检验。

2实验结果

2．1体质量、胸腺/体质量比值及脾脏/体质量比值麦绿素对小鼠体质量影响见表1

麦绿素对小鼠胸腺/体质量比值及脾脏/体质量比值的影响见表2。结果表明，麦绿素各剂量组小鼠的胸腺/体质量比值及脾脏/体质量比值与阴性对照组相比，差异无统计学意义（P>0．05）。

2．2淋巴细胞转化试验对各组加ConA孔与不加ConA孔吸光度差值的均值进行单因素方差分析，组间差异有统计学意义（F=3．84，P

2．3耳廓肿胀试验对各组小鼠右-左耳片重量差均值进行单因素方差分析，组间差异有统计学意义（F=6．94，P

2．4抗体生成细胞试验对各组溶血空斑数均值进行单因素方差分析，组间差异有统计学意义（F=4．12，P

2．5血清溶血素试验对各组抗体积数的均值进行单因素方差分析，组间差异有统计学意义（F=5．01，P

2．6碳廓清试验各组吞噬指数的均值呈逐渐增加的趋势，但经单因素方差分析，组间差异无统计学意义（P>0．05）。结果表明，麦绿素在0．3、0．6和1．2g/(kg・d)剂量时，该项试验结果阴性。结果见表7。

2．7巨噬细胞吞噬试验对各组吞噬率、吞噬指数的均值进行单因素方差分析，组间差异有统计学意义（F=5．98，P

2．8NK细胞活性试验各组NK细胞活性呈逐渐增加的趋势，但经单因素方差分析，组间差异无统计学意义（P>0．05）。结果表明，麦绿素在0．3、0．6和1．2g/(kg・d)剂量时，该项试验结果阴性。结果见表9。

2．9试验结果卫生部的《保健食品功能学评价程序和检验方法规范》中增强免疫力功能检验方法结果判定的原则规定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面中任何两个方面结果为阳性，可以判定具有增强免疫力的功能[2]。结果见表10。

3讨论

目前国内对麦绿素的研究还仅局限于抗氧化[3]、辅助降血脂、降血糖[4，5]，而对于增强免疫力方面的研究未见报道。通过本实验研究表明，麦绿素还具有增强免疫力的功能。此外麦绿素中所富含的各类营养物质相当丰富，所具备的其他功效有待进一步研究。

参考文献

1黄相国，沈裕虎.麦绿素及麦绿素产品的开发前景.麦类作物学报，2003，23（1）：79-80.

2卫生部.保健食品功能学评价程序和检验方法规范，2003.

3邵承斌，吴四维，陈静华.麦草粉的抗氧化作用研究.天然产物研究与开发，2001，13（2）：27-29.

单细胞生物的定义范文篇5

【关键词】糖尿病；组织因子；血栓形成；单核细胞；血小板

2型糖尿病（T2DM）患者有血栓形成倾向，在血管病变的形成和发展中起着相当重要的作用。新近研究表明，血栓性疾病不仅在组织水平，而且在细胞水平已处于高凝状态〔1〕，组织因子（TF）是凝血过程的始动因子，以往认为主要来源于血管内皮，而现在发现外周血细胞中单核细胞能自身合成的TF，血小板亦含有TF〔2〕，后两种细胞含有的TF在T2DM患者血栓形成中的作用，目前国内外研究不多。本文检测了T2DM患者外周血单核细胞和血小板膜表面TF表达情况及活性，探讨其在DM发病机制中的作用。

1对象与方法

1.1对象

按WHODM诊断标准〔3〕确诊的T2DM患者42例，男26例，女16例，年龄55～78〔平均（61.12±10.41）〕岁。根据白蛋白排泄率将其分为单纯性DM组（DM组，22例）和DM合并微血管病变组（DN组，20例）。正常对照22例，男性12例，女性10例，年龄56～77岁〔平均（63.52±11.21）〕岁，排除了血栓性疾病及抽血2w前使用过阿司匹林、肝素等抗凝药物者。

1.2方法

流式细胞仪型号:FACSCalibur，美国BectonDickinson公司，CD62PPE-Cy5、CD61-PE、CD14PE以及同型对照IgG2a均购自BDPharmingen公司。TFFITC同型对照IgG1及SpectrozymeFXa购自AmericanDiagnosticaInc。因子Ⅶa和因子Ⅹ购自上海船夫生物科技有限公司。①标本准备单核细胞荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血100μl及CD14PE、TFFITC单克隆抗体10μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20min，加入FACSLysingSolution(1×)溶血素2ml，混匀后室温暗处反应6～10min，1500r/min离心5min，弃上清液；加生理盐水2ml，低速涡流混匀后1500r/min离心5min，弃上清液，加1%多聚甲醛液500μl，低速涡流混匀后上机检测。血小板荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血5μl及TFFITC、CD62PPECy5、CD61PE单克隆抗体各10μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20min，加1%多聚甲醛液500μl，低速涡流混匀避光保存30min以上，24h内上机检测。②单核细胞膜表面TF活性的测定：外周血单个核细胞（MNC）包括单核细胞和淋巴细胞，但淋巴细胞不表达TF，可采用MNC来研究单核细胞TF活性，MNC分离采用密度梯度法，肝素抗凝血经Hank氏液稀释，加入装有淋巴细胞分离液的试管中，2000r/min离心30min，用毛细吸管吸出MNC，显微镜下确定单核细胞百分率，调单核细胞浓度为3×104/ml。根据TF/Ⅶa复合物可以使因子Ⅹ转变为活化因子Ⅹa的原理，利用发色底物SpectrozymeFXa，测定反应体系因子Ⅹa的生成量，判断单核细胞表面TF活性。在体外分离培养的血液单核细胞（2×104/孔），用HEPES缓冲液〔含CaCl2(5mmol/L)0.1%BSA〕洗涤细胞2次，分别加入因子Ⅶa(100pmol/L)和因子X（135nmol/L），37℃孵育30min，最后在反应体系中加入SpectrozymeFXa（0.5mmol/L）底物，以405nm波长测定反应物的吸光度，换算成FXa生成量（nmol/L）。FXa的生成量与单核细胞表面TF活性成正比。血小板膜表面TF活性的测定：外周血用ACD抗凝，经1000r/min离心10min获得富血小板血浆，用PBS调血小板浓度为2×109/ml，利用发色底物法测定FXa生成，方法同上。

1.3统计学分析

数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件，组间比较采用t检验。

2结果

2.1T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达

正常对照组血小板膜表面CD62P、TF阳性表达率及单核细胞膜表面TF表达率很低，而DM患者均明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表1。表1T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达（略)

2.2T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性

正常对照组血小板及单核细胞膜表面TF活性很低，而DM组较正常对照明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表2。表2T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性（略)

2.3血小板膜表面TF与CD62P表达相关分析

TF的表达与CD62P表达呈明显正相关（r=0.685，P＜0.001），提示二者变化是一致的。

3讨论

T2DM患者血栓形成的倾向在各个环节均有体现〔4〕，主要有血管内皮细胞的损害、血小板的激活、凝血纤溶系统的异常和血液流变学的改变，这些变化在伴有血管病变者更明显，提示两者之间存在密切联系，TF是凝血的启动因子，亦在病理血栓形成中发挥关键作用。既往研究认为TF主要由血管内皮细胞受损后产生，而新近的研究发现，一些血细胞成分：如单核细胞、血小板亦能在活化状态下释放TF参与凝血过程〔5〕，在血栓性疾病中（包括DM）血小板含有TF蛋白水平较正常人高〔6〕，这提示在DM患者中，单核细胞、血小板不仅可以通过已知的方式（如单核细胞释放CD14、血小板黏附聚集释放凝血因子）参与病理血栓形成，还可能以释放TF而独立启动凝血过程及血栓形成。

基于一系列血细胞如单核细胞、血小板、中性粒细胞上TF的发现，人们提出了细胞水平的止血模式〔5〕，该模式认为凝血途径可不依赖于血管内皮细胞释放的TF来启动，在一定条件下这些血细胞释放的TF亦可独立启动凝血过程。这一模式是经典凝血途径的补充。由于在正常情况下，血细胞如单核细胞、血小板是处于静息状态，不释放TF，只有在病理情况下单核细胞、血小板活化，TF才可释放出来，故血细胞来源的TF在血栓性疾病中的意义可能更大。

TF与DM发病紧密相关，DM血管病变者患者外周血单个核细胞中TFmRNA水平、TF活性及外周血TF蛋白水平较单纯DM患者明显增高，并有研究认为血浆中可溶性TF水平是DM合并血管病变患者疾病进展的一个标志〔7〕。本研究在国内首次采用流式细胞术检测了DM患者体内血小板、单核细胞膜表面TF的表达及活性，证实DM患者较正常对照明显增高，而DM合并血管病变者增高更明显，并且血小板膜表面TF的表达与血小板活化标志物CD62P表达成正比。这提示DM患者血细胞释放的TF亦可能参与了其发病过程中高凝状态的形成及病理血栓的生成。研究表明，DM患者体内高血糖，高胰岛素血症、高渗透压可激活体内单核细胞和血小板〔8〕，并能促进单核细胞合成及释放TF，而单核细胞又可以含TF微粒的形式将TF传递给血小板，后者摄取后可将TF贮存至a颗粒中，活化时可将其释放出来；血小板的活化又可进一步促进单核细胞TF活性，它们之间的作用主要是通过血小板膜CD62P介导的，这种相互作用，互为影响可形成恶性循环，促进血栓形成。

参考文献

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5EngelmannB，LutherT，MiilerI.Intravasculartissuefactorpathwayamodelforrapidintiationofcoagulationwithinthebloodvessel〔J〕.ThrombHaemost，2003；89（1）:38.

6黄细莲，陈方平，杜建伟，等.血栓性疾病患者血小板相关组织因子水平及活性的改变及意义〔J〕.中华内科杂志，2005；44（8）：5857.

单细胞生物的定义范文

【摘要】

目的:构建用于RNAi的shRNA（smallhairpinRNA）表达载体及检测其对低氧诱导因子1（HypoxiainducibleFactor1，HIF1）基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子，克隆入酶切处理后的pEGFPC1载体片段中，此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物，退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞，然后用RTPCR和Westernblot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA，RTPCR和Westernblot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1，这对于基因的功能研究具有重要的意义。

【关键词】shRNA表达载体RNA干涉HIF1基因

[Abstract]AIM:ToconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA（shRNA）andtotestitsefficacyinsilencingtheHypoxiainducibleFactor1(HIF1)gene.METHODS:TheH1genepromoterwasamplifiedfromthegenomeofthehumanbloodcellsbyPCR.ThenthepromoterwasclonedintothepEGFPC1vectordigestedwiththerestrictionenzyme.TheconstructedvectorwasnamedpWH1.TheprimerwasdesignedtotargetthehumanHIF1cDNAgene.TheannealedprimerfragmentwasclonedintopWH1.ThenewconstructedplasmidwastransfectedintotheSGC7901cellline.ThentheexpressionlevelofHIF1genewasassayedbyRTPCRandWesternblot.RESULTS:ThenewlyconstructedplasmidexpressedshRNAtotargettheHIF1gene.TheresultsofRTPCRandWesternblotshowedtheexpressionofHIF1genewasreduceddramaticalyinmRNAandatproteinlevel.CONCLUSION:ThesuccessfulconstructionofshRNAexpressionvector(pWH1)providesatoolforfurtherresearchintothefunctionofanovelgene.

[Keywords]shRNA;expressionvector;RNAinterference;HIF1gene

RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（PTGS）的一种。1998年，Fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现，由正义和反义RNA退火形成的dsRNA引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA强10倍以上。dsRNA引起的基因表达抑制不是正义或反义RNA引起的基因表达抑制在数学上的叠加，这就说明dsRNA触发了细胞内的一些反应机制，从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时，他们就把这种现象命名为RNAi。RNAi的应用谱非常广泛，从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫，其次就是果蝇。哺乳动物细胞的RNAi应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。Wianny等[2]将dsRNA用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了RNAi。Sayda等[3]用人工合成的21ntRNA二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了RNAi。Brummelkamp等[4]利用载体表达的shRNA在许多培养的人源，猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi实验中取得了成功。

在真核细胞内，RNA聚合酶III能指导短RNA的表达和RNA聚合酶III结合的启动子有H1，U6等。目前，这两种启动子都被尝试作为表达短RNA的工具。本实验旨在克隆得到的H1启动子的基础上构建一个能稳定表达shRNA的真核载体。然后针对HIF1基因mRNA设计靶标，在培养的SGC7901细胞（胃癌细胞系）内进行RNAi实验，以观察新建的pWH1载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。

1材料和方法

1.1材料pEGFPC1质粒为CLONTECH公司产品;各种限制性内切酶为NEB公司产品。T4连接酶、PfuDNA聚合酶和DL2000DNAmarker为TaKaRa公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。SGC7901细胞由全军消化病研究所保存。SuperscriptII反转录试剂盒购自Invitrogen公司;兔抗人HIF1多抗、兔抗人βactin多抗和WesternblotLuminolReagent为SantaCruz公司产品。Top10菌种由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1以pEGFPC1为框架构建shRNA表达载体pWH1(1)用AseI和MluI双酶切，去掉pEGFPC1质粒上PCMV，EGFP，MCS和SV40polyA等片段，剩余的部分作为构建pWH1的框架。在AseI和MluI之间加上一个接头DNA序列，该段接头DNA由下面2条引物退火形成（退火温度:39.5℃）:序列1:5′TAATGGAATTCGAAGCTTA3′;

序列2:5′CGCGTAAGCTTCGAATTCCAT3′。(2)通过PCR从人血细胞基因组DNA获得H1RNA基因Promoter[5]。取新鲜血液20mL，以1300r/min离心15min，取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15mL抽提缓冲液（10mmol/LTrisClpH8.0，0.1mmol/LEDTApH8.0，20mg/L胰RNA酶，5g/LSDS），37℃温育1h。加蛋白酶K至终浓度为100mg/L，温和混匀。50℃水浴中放置3h。冷却至室温后，用等体积酚和氯仿抽提后，加入0.2体积10mol/L乙酸铵和2体积的乙醇，放置30min，12000r/min离心10min。700mL/L乙醇洗涤2次，空气中晾干。加入1mLTE(pH8.0)溶解DNA，此即人血细胞基因组DNA。以此DNA为模板，PCR引物为:P1:5′CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC3′(含EcoRI位点);P2:5′GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC3′(含HindIII，BglII位点)。PCR产物通过EcoRI和HindIII两个酶切位点克隆入pUC19质粒，进行序列验证。(3)pWH1载体的构建:PCR产物用EcoRI和HindIII双酶切，克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pWH1。

1.2.2用pWH1进行沉默HIF1基因的表达(1)以人HIF1cDNA基因为靶标的引物设计:选取人HIF1cDNA基因(GenBank登录号:AF304431)中的512～530核苷酸为靶标，设计两条引物。序列如下:引物1:5′GATCCCCTGAAGTGTACCCTAACTAGTTCAAGAGACTAGTTAGGGTACACTTCATTTTTGGAAA3′;引物2:5′AGCTTTTCCAAAAATGAAGTGTACCCTAACTAGTCTCTTGAACTAGTTAGGGTACACTTCAGGG3′。(2)构建针对HIF1基因的shRNA表达载体pWH1HIF1。将上面合成的两条引物用TE（pH8.0）稀释成0.5nmol/μL。各取5μL混匀，沸水中放置10min，缓慢冷却至室温4℃-20℃保存备用。用限制性内切酶BglII和HindIII对质粒pWH1做双酶切。用T4连接酶对pWH1质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。铺于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养24h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶EcoRI和HindIII对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pWH1HIF1。（3）转染胃癌细胞系SGC7901:SGC7901细胞用RPMI1640培养液（含100mL/L小牛血清）在37℃、50mL/LCO2条件下培养。转染前24h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中，贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书操作。于转染后48h收集6孔板内细胞，做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72h按1∶10比例传代于60mm直径培养皿中，然后加入适量(400～1000mg/L)G418进行筛选，2周后挑取单个细胞集落，扩大培养，然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。(4)RTPCR检测HIF1基因的mRNA水平:待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时，收集细胞。参照Gibco公司TRIzol试剂使用方法提取细胞RNA，溶于20μLDEPC水内。用SuperScriptTMIIRTkit参照其使用说明进行cDNA第1条链的合成。人βactin内对照引物:P1:5′GGCCGGGACCTGACTGACTAC;P2:5′TCTTTGCGGATGTCCACGTC（长度331bp）。人HIF1RTPCR引物:P3:GATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTG;P4:AGAAAATTTCATATCCAGGCTGT（长度680bp）。PCR反应条件:95℃1min(94℃40s;56℃40s;72℃40s)×26cycle;72℃10min;4℃保存。(5)Westernblot检测HIF1的蛋白水平:已处理的转染细胞样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，100伏转移3h至NC膜上，50g/L脱脂奶粉室温封闭2h，依次加入1∶2500稀释的兔抗人一抗4℃孵育过夜，1∶5000稀释的HRP标记的鼠抗兔二抗作用2h，加入Luminol试剂，并以X光片捕捉HRP催化Luminol试剂所产生的激发光。

2结果

2.1shRNA表达载体pWH1构建的实验结果

2.1.1从人血细胞基因组DNA中扩增得到H1RNA基因PromoterPCR反应体系:DNA模板2μL，P11μL，P21μL，Taq0.5μL，dNTP2μL，10×buffer5μL，H2O38.5μL，总体积50μL。PCR反应条件为:94℃5min(94℃30s;45℃45s;72℃30s)×5cycle;(94℃30s;56℃45s;72℃30s)×25cycle;72℃2min;4℃保存。10g/L琼脂糖凝胶电泳后，在250bp左右可以见到一扩增条带(图1)，大小与理论预计一致。

图1H1基因启动子的PCR扩增电泳结果（略）

Fig1AGEanalysisofPCRproductsencodingH1genepromoter

M:DNAmarkerDL2000;1:PCRofH1genepromoter.

2.1.2重组质粒pUC19H1的酶切鉴定上述PCR产物经EcoRI和HindIII双酶切后，克隆入pUC19载体。阳性克隆命名为pUC19H1（图2）。pUC19H1质粒递交上海生工公司测序，结果显示，与GenBank的H1基因启动子序列（登录号:X16612）完全一致。

图2重组质粒pUC19H1的酶切鉴定结果（略）

Fig2AGEanalysisofrecombinantplasmidpUC19H1digestedwithEcoRIandHindIII

M:DNAmarkerDL2000;1，2:pUC19H1.

2.1.3pWH1双酶切鉴定pEGFPC1质粒经AseI和MluI双酶切后，加上一段由2条引物退火形成的接头DNA，此框架质粒命名为pWK。再利用接头上带有的EcoRI和HindIII酶切位点将pUC19H1质粒上的目的片段亚克隆到这个框架质粒上。新的质粒命名为pWH1(图3)。

图3pWH1质粒的酶切鉴定结果（略）

Fig3AGEanalysisofplasmidpWH1digestedwithEcoRIandHindIII

M:DNAmarkerDL2000;1:pWK;2:pWH1.

2.2pWH1HIF1的酶切鉴定结果将合成的2条引物退火后，从BglII和HindIII两个酶切位点克隆到质粒pWH1。新的质粒命名为pWH1HIF1。用EcoRI和HindIII对pWH1HIF1进行双酶切鉴定（图4），阳性克隆切下约310bp片段，阴性克隆切下约250bp片段。

图4pWH1HIF1质粒的酶切鉴定（略）

Fig4AGEanalysisofrecombinantplasmidpWH1HIF1digestedwithEcoRIandHindIII

M:DNAmarkerDL2000;1:pWH1HIF1;2:pWH1.

2.3pWH1HIF1瞬时转染SGC7901细胞将准备好的pWH1HIF1质粒5μg用脂质体方法转染入SGC7901细胞，48h后收集细胞。用TRIzol试剂抽提细胞RNA，进行RTPCR。12g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图5）可以看出，RNAi后和对照组相比mRNA被明显降解。

图5pWH1HIF1瞬时转染SGC7901细胞后的RTPCR结果（略）

Fig5RTPCRresultofSGC7901cellstransienttransfectedwithpWH1HIF1

M:DNAmarker;1:SGC7901;2:SGC7901transfectedwithpWH1;3:SGC7901transfectedwithpWH1HIF1.

2.4pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞将准备好的pWH1HIF1质粒2μg用脂质体方法转染入SGC7901细胞，按有限稀释法挑取单克隆细胞。用TRIzol试剂抽提细胞RNA，进行RTPCR。12g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图6）可以看出，RNAi后和对照组相比mRNA被明显降解。

图6pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞后的RTPCR结果（略）

Fig6RTPCRresultofSGC7901cellsstabletransfectedwithpWH1HIF1

M:DNAmarker;1:SGC7901transfectedwithpWH1HIF1;2:SGC7901transfectedwithpWH1;3:SGC7901.

2.5Westernblot检测HIF1基因的RNA干涉效果挑取3个稳定转染pWH1HIF1质粒的SGC7901单克隆细胞。用抗HIF1抗体进行Westernblot和化学发光显色（图7）可见，RNAi后和对照组相比HIF1的蛋白表达水平明显下降。

图7pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞后的Westernblot结果（略）

Fig7WesternblotresultofSGC7901cellsstabletransfectedwithpWH1HIF1

1-3:3SGC7901cellclonestransfectedstablywithpWH1HIF1;pWH1:SGC7901cellclonetransfectedstablywithpWH1.

3讨论

RNAi一经发现，立即成为科学研究的一大热点。这是因为RNAi这个生物领域的新兴事物，本身具有它的神秘性，同时又具有广阔的应用前景[6]。RNAi已经被应用到线虫的系统性功能基因组研究上，RNAi作为一个工具，它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。使哺乳动物细胞产生特定基因的功能丧失表型，对于新基因功能研究、新蛋白质药物的开发和基因治疗等方面都具有重要的意义。本实验构建的pWH1载体，能在真核细胞内表达shRNA，shRNA可以有效模仿siRNA，使目标蛋白的mRNA发生特异性的降解。pWH1可被广泛用于真核细胞的RNAi实验模型。

缺氧诱导因子1(HIF1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子，在低氧信号中起到一个重要的中介作用，通过转录水平参与对低氧反应基因的调控，从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应［7］。HIF1在多种肿瘤中广泛存在，它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(hypoxiaresponseelement，HRE)结合，从而启动靶基因的转录表达，同肿瘤的增殖、转移密切相关［8］。Talks等[9]发现大多数恶性肿瘤细胞中有HIF1表达，且HIF1在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞系SGC7901中利用所构建的pWH1载体成功降低了HIF1基因的表达，这对研究胃癌的发生、增殖、多药耐药和治疗等均有重要的意义。

参考文献

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单细胞生物的定义范文篇7

【关键词】高中生物；有丝分裂；特征；意义；多媒体；教学

一、有丝分裂的基本概念

真核细胞分裂产生体细胞的过程就是有丝分裂，这是细胞分裂的基本方式。细胞有丝分裂中，非常关键的性质就是周期性，也就是能够连续分裂的细胞。开始阶段为一次分裂完成，然后结束阶段为下一次分裂完成，这就属于一个细胞周期。其过程包括染色体、有关酶的合成与DNA等。有丝分裂能够让遗传物质精确地世代相传，同时能够让生物个体得到正常的发育和生长，从而让物种绵延的连续性与稳定性得到保障。

二、有丝分裂在各个时期的特征及其意义

分裂间期与分裂期这两个时期就称之为一个细胞周期。在整个细胞周期中，分裂间期与分裂期的时间比例是不均衡的。分裂间期在整个分裂期中的比例为90%左右，分裂期在整个分裂期中的比例为5%到10%左右。可以用一个圆表示细胞周期，对于不同的细胞来说，细胞周期也是相对不同的，部分的细胞周期较长，而部分的细胞周期较短。细胞在做出有丝分裂时，细胞核与细胞质在形态上都会产生变化，这期间被称之为有丝分裂期。有丝分裂的过程是具有连续性的，为方便形容，将其归为以下几个阶段。第一，有丝分裂间期。有丝分裂间期是周细胞的开始，主要有DNA合成前期（G1）、DNA合成期（S）、DNA合成后期（G2）这三个部分组成，在这之中，RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成主要是在G1期与G2期进行完成，DNA的复制在S期进行完成。染色体蛋白质与DNA解旋酶的合成主要是在G1期进行完成，细胞分裂期有关酶与纺锤丝蛋白质的合成在G2期完成。因为染色质没有高度螺旋，所以是以染色质的形式存在，而非染色体，在这个阶段中，使DNA的复制与相关蛋白质的合成得以完成。第二，有丝分裂前期。开始阶段为分裂期，然后到核膜解体完成的一个阶段，在有丝分裂前期被间期细胞进入的时候，核的体积加大，由染色质组成的细染色线慢慢变短加粗，以至染色体的形成。由于在间期中，染色体已经得到复制，因而任何一条染色体都是通过两条染色单体组成。核仁在前期的后半段时间逐步消失，在前期最后的时间，核膜裂开，从而使染色体在细胞质中散掉。动物细胞有丝分裂前期时靠近核膜有两个中心体，中心体放射出星体丝，也就是放射状微管，带有星体丝的两个中心体慢慢分开，移向相对的两端，核膜破裂后，在细胞的两端之间开始形成纺锤体。第三，有丝分裂前中期。是从核膜破裂开始到染色体排列在赤道面上结束的一个时期，纺锤体的最终形成与染色体向赤道面的运动是其主要过程。

纺锤体分为两类，包含有星纺锤体与无星纺锤体。其中有星纺锤体包含纺锤丝，也称之为微管，包含星体微管、极微管与动粒微管，而无星纺锤体则只包含极微管和着丝点微管。第四，有丝分裂中期。开始阶段是从染色体排列至赤道面上，然后至它们的染色单体。在分向两端以前，这段期间则被称之为分裂中期，有的时候会将分裂前中期也包含在分裂中期里面，中期染色体缩短加粗，则是对这个物种独有的数目与形态的表现。第五，有丝分裂后期。是任何一条染色体的两条姐妹染色单体分开，同时向两端移动的阶段。分开的染色体被称之为子染色体，子染色体到达两端时后期结束，其向两端的移动主要是依靠纺锤体的活动来完成。第六，有丝分裂末期。从子染色体到达两端开始，然后形成两个子细胞结束，子核的形成与细胞体的分裂是这个阶段的主要过程。形成子核的过程基本上就是和前期正好相反的经历。这时到达两端的子染色体，应当先解螺旋，然后轮廓消失，其附近汇集核膜成分，经相互交融之后变成子核的核膜，核内产生核仁，细胞裂开并分为两个，从而形成两个子细胞。在这个阶段产生了细胞板，细胞板能够形成植物细胞的细胞壁。有丝分裂，就是把亲代细胞的染色体通过复制（实际上是DNA的复制）之后，准确的将其均匀分拨在两个子细胞里，因为染色体上带有遗传物质DNA，所以在生物的亲代和子代之间，使遗传性状的稳定性得到维持。由此可以得知，在生物的遗传过程中，细胞的有丝分裂具有非常关键的意义。

三、结束语

综上所述，有丝分裂在任何的分裂方式中，都占领非常关键的位置。有丝分裂使组织与细胞之间的遗传的统一性得到了保证，对人类能够正常的生活与延续至关重要。因而，在高中生物中，对于学习有丝分裂的内容也是非常重要的。

参考文献

[1]苏楠楠.剖析高中生物有丝分裂[J].考试周刊,2014(59):142-142.

单细胞生物的定义范文篇8

5?fu、as2o3、hcpt与pei?asodn物联合使用后，其ic50分别降低到3.9μg/ml、2.67μmol/l、1.46μg/ml,化疗药物的敏感性分别提高到单用化疗药物的2.86、1.84和4.01倍。结论pei介导的pkc?αasodn与化疗药物5?fu、as2o3、hcpt联合使用,可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,通过与化疗药物的相加或协同作用,减少化疗药物的用量。

【关键词】蛋白激酶c我反义核酸们肝肿瘤化学治疗聚乙烯亚胺

原发性肝癌是一种对化疗药物不敏感的恶性肿瘤[1]。有报道在肝细胞癌变过程中,细胞信号转导异常起到了关键的作用,其中pkc?α表达异常与肝癌的发生发展密切相关[2,3]。反义寡脱氧核苷酸可以通过转录后抑制来抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡，但是细胞摄取率低、易被核酸酶水解，且使用剂量过大，费用昂贵。阳离子聚合体pei作为asodn载体可以显著提高其转染效率[4]。临床常规抗肿瘤药物虽然抗肿瘤效果肯定，但是其毒副作用大，易产生耐药性，病人耐受差，同样难以起到令人满意的效果[5?7]。因此，本实验研究旨在探讨用聚乙烯亚胺作为载体，pkc?αasodn联合5?fu、hcpt、as2o3等常规抗肿瘤药物作用于肝癌细胞，增强常规化疗药物的抗肿瘤作用，降低用药剂量，从而提高病人的生存时间和生活质量，减轻病人的经济负担。

1材料与方法

1.1细胞培养人肝癌smmc?7721细胞由中山大学生物化学教研室惠赠；用含10%新生牛血清，rpmi1640培养。

1.2试剂cck?8（cellcountkit?8）试剂（日本同

仁化学研究所）；新生牛血清（天津tbd?广州展晨）；pkc?αasodn（北京塞百盛基因技术有限公司）,全硫代修饰,page纯化,-20℃冻存,使用前用无酚红rpmi1640培养液溶解。pkc?aantisense：5′?gttctcgctggtgagtttca?3′。

1.3wst?8法检测细胞增殖抑制率取对数生长期、苔盼兰拒染率>95%的细胞,调整浓度为5×104/ml,每孔100μl,接种于96孔板,设3复孔,培养4h,待贴壁达40%～50%后,加入药物。设空白对照组、单纯asodn组、单纯化疗药物组、asodn联合化疗药物组和pei?asodn联合化疗药物组,各组pkc?αasodn浓度均为0.25μg/ml;pei与pkc质量比为3∶4，见表1～3；培养48h后,每孔加入cck?8试剂10μl,继续培养1h,多功能酶标仪(bio?rad)测定吸光度a450nm(激发波长450nm,参比波长655nm),计算增殖抑制率及各组ic50；增殖抑制率＝[a（对照组）－a（实验组）]/a（对照组）×100%；各化疗药增敏倍数＝单纯用药组的ic50/联合用药组的ic50。

1.4统计学方法所有数据均用±s表示，使用统计软件spss13.0。

1.5金正均q值法[8]判断化疗药物与反义核酸联合使用的效果q=ea+b/(ea+eb?ea×eb),ea和eb分别为单用反义核酸和单用化疗药物的抑制率,ea+b为合并用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”,分母是“期望合并效应”,q值是两者之比,q<0.85为拮抗,0.85≤q<1.15为相加,q≥1.15为协同。2结果

2.15?fu与pei?asodn联合使用效果单用5?fu的ic50为15.64μg/ml;5?fu与asodn联合使用,表现为拮抗作用(q<0.85),ic50为26.74μg/ml;5?fu与pei?asodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15),ic50为3.9μg/ml,增敏倍数为4.01,见表1、4。

2.2as2o3与pei?asodn联合使用效果单用as2o3的ic50为4.93μmol/l;as2o3与asodn联合使用,表现为拮抗作用(q<0.85),ic50为5.33μmol/l;as2o3与pei?asodn联合使用,表现为相加作用(0.85≤q<1.15),ic50为2.67μmol/l,增敏倍数为1.84，见表2、4。

2.3hcpt与pei?asodn联合使用效果单用hcpt的ic50为4.18μg/ml;hcpt与asodn联合使用,表现为相加作用(0.85≤q<1.15),ic50为3.1μg/ml，增敏倍数为1.34;hcpt与pei?asodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15),ic50为1.46μg/ml,增敏倍数为2.86,见表3、4。

3讨论

蛋白激酶c已经成为肿瘤研究领域的热点之一。研究发现,pkc?α磷酸化后活化多种蛋白分子，引起分化、增殖、胞膜转运、基因表达等一系列细胞反应。药物或反义技术封闭pkc?α表达和活性,可以抑制肿瘤细胞的生长、促进凋亡、抑制侵袭转移,以及增强对化疗药物的敏感性[9]。研究表明pkc?α反义核酸可以抑制胰腺癌、宫颈癌等肿瘤的表1不同浓度的5?fu及其联合asodn或pei?asodn对smmc?7721细胞增殖抑制作用的比较表2不同浓度的as2o3及其联合asodn或pei?asodn对smmc?7721细胞增殖抑制作用的比较(μmol/l)表3不同浓度的hcpt及其联合asodn或pei?asodn对smmc?7721细胞增殖抑制作用的比较as为asodn；p?a为pei?asodn增殖[10?12]。因此，我们针对蛋白激酶cmrna的sd序列上游非编码区设计合成反义核酸，阻断与pkc?α相关的信号通路来抑制肿瘤生长、促进其凋亡。

本实验选用肝癌常用药物5?fu、as2o3及hcpt分别与pei?asodn联合使用。结果表明：化疗药物与pei?asodn联合使用组的ic50最低,分别将smmc?7721细胞对5?fu、as2o3、hcpt的敏感性分别提高到单用化疗药物4.01、1.84、2.86倍，这是由于asodn和化疗药物通过不同的机制共同作用于肝癌细胞,提高了肝癌细胞对化疗药物的敏感性所致。金正均q值法[8]分析化疗药物与反义核酸的相互作用表明:pei?asodn与5?fu、hcpt联合使用,均表现为协同作用;与as2o3联合使用,仅表现为相加作用，联合作用效果不如5?fu、hcpt明显，原因可能是带负电荷的asodn增加了细胞膜外的电负性，影响了细胞对as2o3的摄入。而线性pei作为一种高效、低毒的阳离子聚合物,能和dna形成中性或者带正电的复合物,即pei?asodn，不仅介导asodn的摄入，而且通过中和部分细胞膜外的负电荷来促进化疗药的摄入，通过不同的机制共同作用肝癌细胞，抑制生长、促进凋亡。

肝癌属于对化疗敏感性差、耐药性强的恶性肿瘤,而肝癌患者常患肝硬化和慢性肝炎,肝功能差,不易耐受长期、大剂量的化疗。本实验通过联合使用化疗药物和pei?asodn，既能减少反义核酸的使用量,又可减少化疗药物的剂量,对于肝癌治疗中减少药物的毒副作用,增强化疗药物的疗效有很好的效果。

【参考文献】

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单细胞生物的定义范文

1材料与方法

1.1细胞系

人膀胱癌株t24常规培养。

1.2寡核苷酸（odns）?脂质体（lip）转染复合物

硫代磷酸修饰的寡核苷酸序列如下：反义序列：5′?cccagccttccagctccttg?3′；正义序列：5′?caaggagctggaaggctggg?3′，均引自genebank。脂质体lipofectamine2000，按转染试剂盒说明配置不同浓度的odns?lip复合物。

1.3westernblot印迹试验

转染48h收集细胞，triton试剂提取细胞总蛋白，紫外分光光度仪测定蛋白含量。调整至蛋白浓度2g/l，取10μl样品加20μl样品处理液，95℃水浴加热4min，冷却至室温。于sds?聚丙烯酰胺凝胶中加样品15μl，指示剂至电泳槽下缘边缘时取出胶版，以电转印仪将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上。以封闭蛋白干粉1g加0.02mol/lpbst100ml，37℃封闭1.5h。用0.02mol/lpbst洗涤硝酸纤维素膜。dab染色，照相。重复8次。

1.4mtt试验

t24细胞起始浓度为1×104/孔。反义odns?lip复合物100、200、400nmol/l为转染组；正义odns?lip复合物400nmol/l和空白作为对照组。作用24h、48h及72h后经酶标分析仪于570nm波长检测吸光度。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡变化

取对数生长期的t24细胞，浓度为2×105个/ml。400nmol/l反义odns?lip复合物进行转染，对照组应用rpmi?1640培养液。流式细胞仪分别于24h、48h及72h进行细胞凋亡检测。

1.6统计学方法

采用imagetool软件分析westernblot图像灰度值，应用单因素方差分析和q检验，p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1westernblot印迹试验

反义复合物处理t24细胞48h，随着浓度增加，survivin蛋白表达水平下降，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表1。表1westernblot印迹试验结果(±s)

2.2mtt法检测细胞抑制率

反义复合物处理t24细胞后，随着浓度与作用时间的增加，细胞生长抑制率逐渐增高，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表2。

2.3流式细胞仪检测细胞凋亡

t24细胞经作用后，流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表3。表3400nmol/l反义寡核苷酸作用不同时间后细胞凋亡率

3讨论

survivin是一些恶性肿瘤有潜在价值的诊断标志和预后因子，其存在预示着肿瘤组织分化不良，临床分期高，5年生存率及总生存率下降，无瘤生存时间缩短，复发率增加[3，4]。survivin是肿瘤特异性的凋亡抑制蛋白，在成人大多数肿瘤组织中表达水平异常升高[5]。可采取抑制其表达或干扰其作用的策略来治疗肿瘤，其分子靶向治疗单独或与其他抗癌治疗联合应用，可抑制体外肿瘤的形成及已形成肿瘤的生长[6]。

本研究中westernblot印迹试验表明survivin反义复合物可以下调t24细胞survivin蛋白表达，其表达水平随着反义复合物浓度的增加而进行性下降。提示脂质体的反义转染是成功的，反义survivin复合物可以明显下调t24细胞survivin蛋白的表达，并呈现一定的浓度依赖性。mtt结果显示t24细胞凋亡率随处理时间的延长而呈现增加趋势。流式细胞仪检测出t24细胞经反义surivin复合物处理后出现典型的细胞凋亡亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加。亚二倍体峰的出现与增加是量化膀胱癌细胞凋亡的客观指标，说明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，且凋亡细胞率有一定时间依赖性。

研究表明，survivin分子靶向治疗可通过诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管形成的双重机制来发挥抗肿瘤作用[7]。高凋亡指数组患者的5年生存率明显高于低凋亡指数组，说明诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的抗肿瘤治疗手段[8]。本组资料表明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导体外培养人t24膀胱癌细胞发生凋亡，可能为膀胱癌的综合治疗提供新的方法。

【参考文献】

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单细胞生物的定义范文1篇10

关键词：端粒酶RNA反义核酸;宫颈癌Hela细胞;抑制作用;机理

宫颈癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且随着人们生活节奏的加快其发病率出现上升趋势。患者发病后临床上主要表现为：阴道流血、阴道排液等，影响患者生活质量[1]。目前，临床上对于宫颈癌尚缺乏理想的治疗方法，常规方法虽然能够改善患者症状，但是长期疗效欠佳，治疗预后较差。根据相关研究结果显示：端粒酶RNA（hTR）模板区及端粒酶RNA催化亚单位（hTERT）区的反义核酸，具有序列特异性，能够明显抑制宫颈癌细胞端粒酶活性，抑制细胞的生长。因此，临床上研究端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用具有重要意义[2]。为了探讨端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及其机理。对2013年4月至2014年4月我院收治的100例宫颈癌患者资料进行分析，报告如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

对我院收治的100例宫颈癌患者资料进行分析，并将其设置为正义核酸组、反义核酸组，每组有患者50例，正义核酸组患者年龄为（36～68）岁，平均年龄为（52.8±0.3）岁，患者从发病到治疗时间为（1～7）月，平均时间为（3.1±0.6）月;反义核酸组患者年龄为（38～66）岁，平均年龄为（51.3±1.1）岁，患者从发病到治疗时间为（1～8）月，平均时间为（4±1.0）月。设置50例同期入院宫颈癌患者为对照组，患者年龄为（35～69）岁，平均年龄为（52.4±0.9）岁，患者从发病到治疗时间为（1.2～8.7）月，平均时间为（4.3±1.7）月。患者对治疗方案、护理措施等有知情权，患者年龄、病程等差异不显著（P>0.05），具有可比性。

1.2方法

采用四甲基偶氮错蓝法、、PCR-端粒重复序列扩增（TRAP）-酶联免疫吸附实验（ELISA）、吖啶橙染色法、流式细胞术对患者Hela细胞转染反义核酸进行检测，宫颈癌Hela细胞在含有10%新生牛血清的RPMI-1640培养基中，培养温度控制在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行常规培养，取对数生长期细胞用于转染。每次试验均重复三次。MTT法测反义酸对细胞生长的作用。将细胞接种在96孔板上，分别在转染后的1，2，3，4，5天后，采用MTT法测定细胞存活率，并且测定波长为490、630nm时的吸光度（A）值，并且计算其差值，细胞生长抑制率的计算方法为[（A对照组-A实验组）/A对照组]×100%。端粒酶活性检测：分别收集转染后1，2，3天的细胞，根据TRAP试剂盒提供的方法进行检测，并且将实验组Hela细胞的端粒酶活性设置为，将裂解缓冲液作为阴性对照，在酶标仪上测定波长450，690nm的A值，根据以下公式计算实验组相对端粒酶活性。实验组相对端粒酶活性（A实验组-A阴性对照组，对于A>0.20判断为阳性）。同时，取20ulPCR产物，经过12%非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，阳性结果表现为凝胶上出现相差6个核苷酸的DNA条带[3]。细胞形态学观察：将10mg吖啶橙溶解在100mlPH值为6.8的磷酸盐缓冲液（PBS中），并且将其保存着在温度为4℃下并避光保存。取转染后3天的各组细胞，制备成1×07个/ml的细胞悬液;吸取95ul细胞悬液，加入5ul吖啶橙液充分混匀;吸入1滴混合液在洁净玻片上，并将其覆盖、封片，采用显微镜进行观察。细胞凋亡的测定：将转染后3天的细胞进行离心，并采用PBS进行两次洗涤，并加入预冷的70%乙醇进行固定，然后将其放在温度为4℃过箱过也，然后采用PBS清洗，调整细胞浓度到1×106个/ml，加入50ul碘化丙啶并充分混匀，然后采用流式细胞仪进行检测，并进行DNA含量以及细胞周期等进行分析[4]。

1.3统计学方法

相关数据用SPSS16进行统计学分析，计数资料采用卡方检验，并采用n表示，计量资料采用（均数±方差）等表示，并进行t检验，P<0.05表示具有统计学意义。

2.结果

本次研究中，hTR组浓度为0.05时，反义核酸浓度为（28.9±1.8）umol/L、0.1浓度时反义核酸浓度为（43±1.9）umol/L、0.2浓度时反义核酸浓度为（53.8±2.3）umol/L，显著低于正义核酸组（P<0.05），见表1。

本次研究中，hTR组浓度为0.05时反义核酸浓度为（65.2±2.7）umol/L、0.1浓度时反义核酸浓度为（44.9±2.0）umol/L、0.2浓度时反义核酸为（37.3±2.5）umol/L，显著高于正义核酸组（P<0.05），见表2。

本次研究中，hTR组细胞转染反义核酸1天细胞凋亡率变化为（6.4±0.7）、2天细胞转染反义核酸1天细胞凋亡率变化为（1.0±1.1）、3天细胞转染反义核酸1天细胞凋亡率变化为（13.2±1.9），显著低于正义核酸组（P<0.05），见表3。

3.讨论

宫颈癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且随着人们生活节奏的加快其发病率出现上升趋势。根据相关研究结果显示：85%-90%的癌细胞、生殖细胞和干细胞中表达端粒酶活性，并且绝大多数体细胞不表达，由此看出：端粒酶激活是肿瘤以及细胞永生化发生的共同通路。目前已经克隆出的端粒酶亚单位主要有hTR、端粒酶相关蛋白（TP1）等[5]。

反义技术是根据碱基互补配对原则特异性地封闭基因，能够有效的抑制基因的表达，从而达到减少基因产物，抑制细胞恶变的一种全新的基因工程技术。目前，临床上对于端粒酶的反义技术，针对hTR的研究较多。端粒酶和肿瘤之间的特异性，使人们认为它可能是肿瘤治疗新的理想靶点，以抑制端粒酶活性为靶点的反义技术，比单纯针对某个癌基因和抑癌基因的基因治疗具有更加诱人的临床应用前景[6]。近年来，随着我国医疗技术的飞速发展，更多的研究致力于如何缩短反义核酸的迟滞性，如：2-5寡腺核苷酸合成酶与反义核酸结合以及肽核酸、核酶、干扰RNA等的研究。

本次研究中，端粒酶反义hTR能够有效的抑制Hela细胞生长、抑制其端粒酶活性，并且和对照组、正义hTR相比差异显著（P<0.05）。由此说明：反义hTR具有序列特异性，是良好的端粒酶抑制剂。Bachand，Autexier进行了一次实验，实验结果显示：hTR内有两个独立的hTERT结合位点，hTR和hTERT相互作用，两种均是端粒酶活性调节必不可少的因素。当hTR和hTERT的反义核酸同时封笔hTR和hTERT，端粒酶模板区活性以及催化亚单位区活性同时得到抑制，从而引起端粒酶活性得到显著下降，由此也看出：hTR和hTERT呈现协同作用。目前，众多的研究结果显示[7]：端粒酶抑制剂对细胞的增殖抑制作用可能和诱导细胞凋亡有关。实验中我们采用吖啶橙染色，在荧光显微镜下可以看见转染反义hTR的Hela细胞又细胞凋亡的形态学发生改变。通过流式细胞仪检测结果显示hTR细胞凋亡率显著增加[8]。

但是，虽然反义核酸在抑制细胞端粒酶活性、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖等方面仍然还有很多机制不清楚，仍然需要进一步研究。通过本次研究我们可以发现，对于端粒酶hTR的反义核酸均有良好的序列特异性，是理想的抗肿瘤药物。对于端粒酶RNA效果不理想者可以联合催化亚单位反义核酸联合治疗，发挥不同治疗方法优势，为宫颈癌和其他肿瘤基因治疗方面提供更加广阔的应用前景。

综上所述，端粒酶反义核酸能够通过特异性有效的抑制端粒酶活性，诱导细胞凋亡，增强细胞周期阻滞等多种途径抑制宫颈癌Hela细胞生长。

参考文献：

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单细胞生物的定义范文篇11

1、细胞液与细胞内液：细胞液是指（成熟）植物细胞液泡中的液体；细胞内液：动物细胞内的液体。主要区别：存在部位不同、结构不同，成分不同。

2、囊胚和胚囊。囊胚：动物胚胎发育的一个时期，此时期细胞已开始分化，形成内细胞团和滋养层细胞；胚囊：植物子房中胚珠内的结构，即胚珠珠被内的囊状结构，内含卵细胞、极核等。主要区别：部位不同。

3、原生质层和原生质体。原生质层：细胞膜和液泡膜以及两层膜之间的细胞质；原生质体：植物细胞除细胞壁外，细胞膜及内部的所有结构；一个动物就相当于一个原生质体。主要区别：结构不同、范围不同。

4、终止子和终止密码。终止子：DNA（基因）上的脱氧核苷酸序列，相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来；终止密码：mRNA上的核苷酸序列，能使翻译过程终止的密码子。主要区别：位置不同、作用不同、基本单位不同。

5、启动子和起始密码。启动子：位于基因的首端（在DNA上），是与RNA聚合酶识别和结合的部位；起始密码：mRNA上开始翻译蛋白质的密码子。主要区别：位置不同、作用不同、基本单位不同。

6、单倍体和一倍体。单倍体是由某一物种配子直接发育成的个体（含有本物种配子染色体数目的个体），不一定只含有一个染色体组；一倍体：只含有一个染色体组的单倍体。主要区别：单倍体范围大，包含一倍体。

7、赤道板和细胞板。赤道板：是指在有丝分裂中期染色体的着丝点整齐排列的一个平面，是一个虚拟的结构；细胞板：是在植物细胞有丝分裂末期，在原来赤道板的位置上形成的将来要向四周扩散构建成熟细胞壁的结构，是有形成的，实实在在的，其形成与高尔基体活动有关。主要区别：作用不同、含义不同。

8、细胞质和细胞质基质。细胞质：是指在细胞膜以内，细胞核以外的全部原生质，包括细胞质基质、内含物和各种细胞器；细胞质基质：是细胞质中除了细胞器外的液态（胶质）部分，内含水、无机盐、离子、脂类、糖类、氨基酸和核苷酸等，是活细胞进行新陈代谢的主要场所。主要区别：范围不同、细胞质基质属于细胞质的一部分。

9、肾上腺激素和肾上腺素。肾上腺激素：是肾上腺所分泌激素的总称，包括肾上腺髓质和肾上腺皮质激素。肾上腺髓质激素又包括肾上腺素和去甲肾上腺素，肾上腺皮质激素又包括糖皮质激素和少量的性激素；肾上腺素：由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素。在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，引起心跳加快。主要区别：肾上腺素只是肾上腺激素的一种，两者并不是同一概念。

10、呼吸作用、呼吸运动和呼吸。呼吸作用：生物体内的有机物在细胞内经过一系列的氧化分解，最终生成CO2或其他产物，并且释放出能量的总过程；呼吸运动：指由于呼吸肌（膈肌、肋间肌等）的收缩和舒张而使胸腔有节律地扩大和缩小，从而引起的吸气和呼气的运动；呼吸：是在呼吸运动的基础上所进行的宏观气体交换过程。主要区别：含义不同、作用不同。

11、间作、轮作和套作。间作：在同一块田地上，同时期按一定行数的比例间隔种植两种或两种以上作物。间作往往是高茎植物和矮茎植物相互间作，可充分利用光能和CO2，达到增产的目的；轮作：在同一块天地上，按照一定年限或在一年内按一定的季节，轮换栽培几种植物。轮作可合理利用土壤肥力，减轻病虫害，提高生产率；套作：在一种作物生长的后期，种上另一种作物，其共同生长的时间较短。套作可以相对缩短某些农作物的生长周期。主要区别：含义不同、使用目的不同、作用效果不同。

12、化能合成作用和光能合成作用。化能合成作用：是指利用化学反应过程中释放的化学能把无机物合成有机物的过程。例如：硝化细菌的合成有机物的过程就是利用氨气被氧化的过程中释放的化学能把无机物转化成有机物的；光能合成作用：一般指绿色植物通过叶绿体，利用光能，把二氧化碳和水等无机物转化成有机物的过程。例如：绿色植物的光合作用就是利用光能把无机物转化成有机物的。主要区别：使用能量来源不同、合成原理不同。

单细胞生物的定义范文1篇12

【摘要】目的探讨环氧合酶2(COX2)反义核酸对喉癌细胞恶性表型的抑制作用。方法采用脂质体介导方法，分别构建转染COX2反义真核表达载体和空载体的喉癌细胞系Hep2AS和Hep2P细胞。RTPCR及Westernblot分析转染细胞COX2mRNA及蛋白表达水平；MTT比色实验、Boyden侵袭小室法和裸鼠成瘤实验分别检测转染细胞的体外增殖速度、体外侵袭力和体内成瘤性。结果RTPCR结果显示，Hep2AS细胞COX2/磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA比值(0.65)明显低于Hep2(0.92)和Hep2P细胞(0.90)；Westernblot结果提示Hep2AS细胞COX2/βactin比值(0.29)明显低于Hep2细胞(0.46)和Hep2P细胞(0.44)；MTT比色实验显示Hep2AS细胞较Hep2P、Hep2细胞生长速度减慢，三者倍增时间分别为3.6d、2.9d和2.9d；体外侵袭实验结果表明，Hep2AS侵袭细胞数(18.20±5.97)显著低于Hep2细胞(45.40±8.12)及Hep2P细胞(44.10±6.47)(P

【关键词】喉癌；核酸；环氧合酶2

ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectofantisensenucleicacidofcyclooxygenase2(COX2)inmalignantphenotypeoflaryngealcancercellsandthemechanismofCOX2incarcinogenesisoflaryngealcancer.MethodsUsingLipofectamineTM2000reagent，theCOX2highlyexpressedinhumanlaryngealcancercelllineHep2wastransfectedwithantisenseeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1/hCOX2(-)andcontrolplasmidpcDNA3.1(namedasHep2ASandHep2Pcells，respectively).SemiquantitativeRTPCRandWesternblotwereusedtotestifythemRNAandproteinlevelinthetransfectedcells.MTTassay，Boydenchamberandtumorimplantationexperimentwereusedtodetecttheproliferation，invasionandtumorigenesisofthetransfectedcellsinvitroandinvivo.ResultsRTPCRanalysisindicatedthattheratioofCOX2mRNAtoGAPDHmRNAinHep2AScells(0.65)wassignificantlylowerthanthatinHep2(0.92)andHep2Pcells(0.90)(P

KEYWORDS:laryngealneoplasm;nucleicacid;cyclooxygenase2

环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)与人类肿瘤密切相关，文献报道喉癌组织有COX2的高表达[1]。流行病学研究及动物实验均表明非甾体类抗炎药(NSAID)对结肠、直肠癌具有防治作用[2]，并认为这种作用与抑制COX2有关。本研究通过反义核酸技术，抑制人喉癌细胞中COX2的异常表达，观察喉癌细胞生物学行为的改变，探讨COX2在喉癌发生及其恶性生物学行为中的作用。

1材料与方法

1.1材料人喉表皮样癌Hep2细胞系购自第四军医大学口腔医院生物学教研室。SPF级BALB/C小鼠，由第四军医大学实验动物中心提供并饲养。人COX2反义真核表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)由第四军医大学西京医院消化内科吴汉平构建[3]并惠赠。脂质体LipofectamineTM2000购自美国GibcoBRL公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，Boyden侵袭小室购自美国BD公司，羊抗人COX2多克隆抗体购自美国SantaCruze公司。

1.2细胞培养Hep2细胞常规培养于含10mL/L灭活胎牛血清的RPMIl640培养液中，37℃、50mL/LCO2孵箱培养。

1.3COX2反义核酸转染接种Hep2细胞于6孔板培养至80%融合，转染前24h更换为无血清RPMI1640培养液。实验分3组：COX2反义核酸转染组，空载体pcDNA3.1对照组，未转染空白组。配制A液：250μL无血清RPMI1640培养液(3组分别加入3μgpcDNA3.1/hCOX2(-)质粒、pcDNA3.1质粒或不加任何质粒)，B液：250μL无血清RPMI1640培养液加入6μL脂质体LipofectamineTM2000。将3组A、B液混合，培养4h后，更换为含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液，继续培养48h。各组细胞倍比稀释(1∶10，1∶50，1∶250)后接种至24孔细胞培养板，换用含G418筛选培养液继续培养2周后，随机挑取转染组及对照组细胞克隆，扩大培养2个月，分别命名为Hep2AS、Hep2P细胞，未转染空白组细胞仍称为Hep2细胞。

1.4RTPCRCOX2上、下游引物为：5′CCGAGGTGTATGTATGAGTG3′，5′AACTGATGCGTGAAGTGCTG3′；内参基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上、下游引物为：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′(由上海生物工程有限公司合成)。Trizol法提取稳定转染的Hep2AS、Hep2P和Hep2细胞总RNA，按试剂盒说明将2μg总RNA逆转录为cDNA，将cDNA产物进行PCR扩增，GAPDH终产物486bp，COX2终产物232bp。PCR产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.5Westernblot收集对数生长期Hep2、Hep2AS、Hep2P细胞并进行裂解，依次行SDSPAGE，转印NC膜，80g/L脱脂奶粉TBS中37℃振摇1h，加入羊抗人COX2多克隆抗体(1∶1000)4℃摇床过夜，TBST洗涤后加入HRP兔抗羊IgG室温作用3h，增强化学发光法显色照相。

1.6MTT比色实验取对数生长期的Hep2、Hep2AS及Hep2P细胞，制备单细胞悬液，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板，每种细胞设6个复孔，并设空白对照。分别在接种后第1、3、5、7天进行MTT比色实验。

1.7体外细胞侵袭力测定采用Boyden侵袭小室法，按照文献[5]方法操作。37℃、50mL/LCO2条件下培养20h后，常规HE染色，200倍光镜下取5个视野，计数膜下方的细胞数。实验重复3次，取均数。

1.8裸鼠移植瘤实验随机分为3组，每组3只裸鼠，分别接种对数生长期的Hep2、Hep2AS及Hep2P细胞，细胞密度为4×107个/mL。抽取瘤细胞悬液接种于裸鼠背部皮下，每个部位注射0.2mL含活细胞数8×106。从接种之日起，观察裸鼠精神、饮食及体积变化情况。每7d测量肿瘤结节大小，计算肿瘤体积。28d后处死裸鼠，取瘤体测量肿瘤结节大小，计算肿瘤体积并固定，切片行HE染色，观察显微结构改变。

1.9统计学处理采用SPSS10.0统计分析软件，组间分析采用t检验，侵袭力测定分析采用单因素方差分析，移植瘤体积以±s表示，分析采用重复测量数据的方差分析，P

2结

果

2.1人喉癌细胞COX2mRNA表达反义核酸转染引起人喉癌细胞COX2mRNA表达下调。在对照GAPDHmRNA丰度基本相等的情况下，亲本Hep2细胞及空载体转染Hep2P细胞COX2mRNA丰度基本相同，分别为110.8、108.6，而反义核酸转染Hep2AS细胞COX2mRNA丰度明显降低，为83.8。Hep2AS细胞COX2/GAPDHmRNA比值(0.65)明显低于Hep2细胞(0.92)和Hep2P(0.90)(P

2.2人喉癌细胞COX2蛋白表达反义核酸转染引起人喉癌细胞COX2蛋白表达下调。在对照βactin蛋白丰度基本相等的情况下，Hep2细胞与空载体转染Hep2P细胞COX2蛋白丰度基本相同，分别为45.2、43.8，而反义核酸转染Hep2AS细胞COX2蛋白丰度明显降低，为29.1。Hep2AS细胞COX2/βactin比值(0.29)明显低于Hep2细胞(0.46)和Hep2P细胞(0.44)(P

2.3反义核酸转染后人喉癌细胞增殖速度变化Hep2AS、Hep2P、Hep2细胞的倍增时间分别为3.6、2.9、2.9d。提示Hep2AS细胞生长速度较Hep2P、Hep2细胞慢，差异有统计学意义(P0.05)。

2.4各组细胞侵袭力结果反义核酸转染导致人喉癌细胞体外侵袭力下降。Hep2、Hep2P、Hep2AS组侵袭细胞数分别为34.5±6.21、32.01±5.79、16.02±7.59。提示Hep2细胞未转染组及空载体转染组细胞侵袭力相似，而反义核酸转染组细胞侵袭力显著低于前两者，差异有统计学意义(P

2.5裸鼠荷瘤实验结果反义核酸转染导致人喉癌细胞体内成瘤性降低。Hep2和Hep2P细胞接种裸鼠后第5天可见肿瘤长出，Hep2AS细胞接种裸鼠后第7天可见肿瘤长出。第9天开始测量肿瘤体积，以后每7d测量1次(表1)。方差分析表明，转染反义核酸的细胞成瘤性显著低于未转染细胞及转染空载体对照细胞，差异有统计学意义(P

3讨

论

近年的研究发现，结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等多种人类肿瘤COX2的表达明显增高，抑制COX2表达有可能预防和逆转肿瘤发生，表明COX2在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[45]。

COX是催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，有3种同工酶形式：COX1、COX2和COX3。COX1呈组成性表达，由看家基因编码，与正常细胞的前列腺素合成有关；COX2为诱导性表达，正常情况下多数细胞中不表达，仅在炎症状态受细胞因子和有丝分裂原刺激等情况下表达增强；COX3是新近发现的COX1剪切变异体，在人类大脑皮质及心脏有丰富表达[6]。

COX2抑制剂阿司匹林、舒林酸或尼美舒利可降低啮齿类动物化学致癌模型中膀胱癌的发生率，表明COX2可促进膀胱癌的发生[78]。OKAJIMA等[9]研究发现选择性COX2抑制剂可明显抑制表达COX2的裸鼠移植瘤生长。王佳蓉等[1]观察76例原发性喉癌中COX2表达情况，COX2阳性表达组血管生成明显多于阴性表达组，证实COX2可促进肿瘤区域的血管增殖，从而参与喉癌血管生成，促进肿瘤生长。本实验选择COX2高表达的喉癌细胞系Hep2作为研究对象，利用反义核酸技术，将COX2编码cDNA序列反方向插入真核表达载体并转入COX2高表达的喉癌细胞，使之在胞内稳定、持续转录COX2基因的互补RNA链以封闭靶基因，从而制备了目的基因表达持续下调的细胞模型。虽然反义核酸技术目前由于载体的安全性、靶向性等实际问题而距临床应用尚有较远的距离，但仍不失为一种研究特定基因功能有效的实验方法。利用脂质体介导的基因转染方法，初步获得了稳定表达COX2反义RNA的喉癌细胞，通过RTPCR及Westernblot方法证实其COX2mRNA及蛋白表达水平显著下降。MTT比色实验显示反义核酸转染细胞体外增殖速度明显低于亲本细胞Hep2。Boyden侵袭小室法比较反义核酸转染前后细胞体外侵袭力改变，结果发现反义核酸转染细胞体外侵袭力显著低于未转染细胞及转染空载体细胞，说明COX2基因表达可促进喉癌细胞侵袭转移，是肿瘤细胞侵袭转移能力的一个正调控因子，抑制COX2基因表达可抑制喉癌细胞侵袭转移。裸鼠成瘤实验亦表明反义核酸转染细胞体内成瘤性下降，进一步证实了COX2的促癌作用。以上结果均表明COX2高表达确实与肿瘤细胞增殖、致瘤、侵袭转移等恶性表型密切相关，是引起肿瘤细胞恶性表型的相关基因之一。目前许多抗肿瘤药物临床疗效不理想，原因之一可能是肿瘤细胞表达COX2增加，诱导抗凋亡基因Bcl2的表达。因此，开发特异性COX2抑制剂将为喉癌防治开辟新的方向。

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