细胞研究范文

[关键词]树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞；DC-CIK细胞；乳腺癌；免疫治疗

[中图分类号]R73[文献标识码]A[文章编号]1674-0742（2015）03（b）-0124-03

树突状细胞（Dendriticcells，DC）是机体内重要的抗原提呈细胞，可激发B和T淋巴细胞介导的免疫反应[1]。细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine-inducedkillercell，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子及抗体共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性[2]。DC能识别处理肿瘤细胞，并把肿瘤细胞的相关信号传递给CIK细胞，使之发挥杀伤肿瘤细胞的功能。因此，DC能显著提高CIK细胞针对肿瘤细胞的杀伤活性[3]。[A1]本次实验的起止时间为2012年10月―2013年7月，实验从正常人外周血中分离DC和CIK，来诱导培养DC、CIK产生DC-CIK细胞，然后通过对比DC-CIK细胞和化疗药物顺铂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制效果，来探索一种更为有效的免疫治疗方法，为临床研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1试剂

DMEM（EaglemediumandmodifiedEaglemedium）（GibcoInvitrogen公司）；Fetalbovineserum（GibcoInvitrogen公司）；penicillinandstreptomycin（GibcoInvitrogen公司）；trypsin0.25%withEDTA（GibcoInvitrogen公司）；7.5%BSA（GibcoInvitrogen公司）；IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α及CD3单抗（Cytolab公司）。

1.2方法

1.2.1CIK细胞的诱导和扩增取健康成年人外周全血30mL，用等量Ficol1分离出PBMC。调细胞浓度为1×106/mL，置于37℃、5%CO2培养箱培养2h。收集非贴壁细胞，用含10%人AB血清的IMDM调细胞浓度为1×106/ml，并加人1000U/mL的IFN-γ悬浮培养，24h后加入50ng/mL的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，每隔3d半量换液1次，补充rhIL-2，调整细胞浓度始终为1×106/mL。在培养的第7d，收获CIK细胞。然后加入新鲜DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。

1.2.2DC的体外培养在PBMC培养2h之后的贴壁细胞中，加入含1000U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4的GT-T551无血清培养液，37℃、5%CO2培养箱培养。每3d换液1次并补充细胞因子，诱导单核细胞向DC细胞分化，在培养的第7d，加入500U/mL重组人TNF-a，诱导DC细胞成熟；共培养到第9d。收获DC细胞。

1.2.3DC与CIK细胞共培养将DE与CIK细胞混合，比例为DC：CIK=1：5，培养液为CIK培养液。无血清培养液中添加重组人IL-2（300U/mL）。

1.2.4细胞传代培养采用冻融法。消化收集对数生长期的MCF-7细胞，用PBS液离心洗涤2遍，再用PBS液重悬为1×107/mL，封装入冻存管。

1.2.5DC-CIK作用于MCF-7将MCF-7细胞稀释为5×105个细胞/mL的浓度，每孔100μL加入96孔板培养24h。将培养好的DC-CIK细胞，稀释为5×106/mL及10×106/mL的浓度，每孔100μL加入到已经培养24hMCF-7细胞的96孔板中，置于37℃CO2培养箱共同培养。每个组共设5个重复孔。在共培养时间上分为12、24和48h3个组别。每个96孔板上均设置空白对照组，对照组不干预。

1.2.6顺铂作用于MCF-7将顺铂加入到已经培养24hMCF-7细胞的96孔板中，使顺铂在96孔培养板中的终浓度依次为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL。然后加入培养基补足够200μL。置于37℃CO2培养箱共同培养。每个组共设5个重复孔。在共培养时间上分为12、24和48h3个组别。每个96孔培养板上均设置空白对照组。

1.2.7MTT检测MCF-7的增殖在转染12、24、48h后采用MTT法检测MCF-7细胞的凋亡情况。将各组细胞制成浓度为2000个/ml的细胞悬液，然后将200μL/孔的细胞悬液接种到96孔板中继续培养，在12h后每孔加入20μLMTT（5mg/mL），再在37℃条件下培养4h；弃去上清液，每孔加入DMSO为150μl，37℃条件下振荡15min，使用酶标仪490nm波长测定A值。并记算各组的杀伤率。杀伤率=[1-（实验孔A值-效应细胞对照孔A值）/靶细胞对照孔A值]×100%。

1.3统计方法

采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，计量数据以（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P

2结果

2.1DC-CIK作用于MCF-7后MCF-7的增殖情况

在显微镜下观察MCF-7细胞增殖情况。在加入DC-CIK后，MCF-7细胞出现了部分凋亡现象，对照组MCF-7细胞呈现正常生长状态。

在使用MTT法检测DC-CIK作用于MCF-7后12、24、48h细胞增殖情况显示，加入5×106/mLDC-CIK细胞后，MCF-7细胞的凋亡率分别为18.3%、26.0%、35.6%，加入10×106/mLDC-CIK细胞后，MCF-7细胞的凋亡率分别为25.8%、42.3%、58.6%，对照组为3.5%，杀伤作用与作用时间及效靶比均呈正相关，L

2.2化疗药物顺铂作用于MCF-7后的增殖情况

化疗药物顺铂作用与MCF-7细胞后显示出对增殖的明显抑制作用，而且随着作用时间及顺铂浓度的增加，抑制的效果也越明显。L值均

2.3DC-CIK和顺铂对MCF-7增殖抑制作用的比较

将DC-CIK和顺铂对MCF-7增殖抑制作用的进行比较，结果显示，5×106个细胞对MCF-7细胞增殖12h的抑制作用与40ng/ml浓度的顺铂对MCF-7细胞增殖12h的抑制作用相等同，而作用24h的抑制作用与50ng/mL顺铂对MCF-7细胞增殖24h的抑制作用相等同，作用48h的的抑制作用与60ng/mL顺铂对MCF-7细胞增殖24h的抑制作用基本相等同。

3讨论

DC-CIK细胞具有很多优点，对原发性、转移性肿瘤均有良好的疗效，并且对多重耐药、放化疗无效的肿瘤细胞也有效；可以明显的预防肿瘤的复发；能够显著地提高机体免疫力，激发全身性的抗癌效应[4-5]。目前DC-CIK细胞对乳腺癌细胞作用的研究还处在起步阶段，刘苗等[6]研究发现，DC-CIK细胞在体外可以大量增殖，溶瘤作用强。另有研究表明，CIK细胞的溶瘤率为15%，而DC-CIK细胞溶瘤率可以达到71%，且能诱导机体分泌高水平的IFN-γ，可调节和增强机体的免疫功能，提高间接杀瘤作用[7-8]。该研究着眼于实验室基础性研究，通过DC-CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞增殖的体外作用实验，发现DC-CIK细胞对MCF-7细胞增值存在很好的抑制作用，杀伤癌细胞作用与作用时间及效靶比均呈正相关；在某一浓度与作用时间上，DC-CIK细胞与顺铂对MCF-7细胞的抑制有相同作用，DC-CIK细胞对MCF-7细胞具有与顺铂类似的增殖抑制作用，并且，该研究结果提示DC-CIK法可以取得化疗药物相同的对乳腺癌细胞的增殖抑制作用，且无化疗药物的副作用，为进一步临床实验打下了坚实的基础，在临床治疗乳腺癌方面具有很高的应用价值。

目前，DC-CIK细胞在成人肿瘤的临床治疗已经开展，但开展时间较短，数据也不丰富，需继续扩大DC-CIK细胞治疗的临床应用范围，以获取更多的临床资料。另外，DC-CIK细胞与天然药物、其它药物，甚至疫苗结合杀伤肿瘤细胞也是一个很好的研究方向。曲佳等[9]将冬凌草甲素与DC-CIK细胞结合杀伤人多发性骨髓瘤RPMI8266细胞，发现冬凌草甲素能明显提高DC-CIK细胞的杀瘤活性。李雄兵等[10]将卡介苗与DC-CIK细胞联合应用于裸鼠结肠癌肝转移的抑制作用，取得了良好的效果，也为DC-CIK细胞的临床应用提供了宝贵的经验。

综上所述，随着医学生物科技的迅猛发展，细胞免疫治疗逐渐成为一种崭新的治疗模式，尤其是DC-CIK细胞，目前已经小规模应用于临床治疗恶性肿瘤，并取得了很好的治疗效果。在目前的癌症多学科综合治疗理念下，为使乳腺癌患者获得最佳的治疗效果，在接受手术、放化疗等标准治疗后，细胞免疫治疗不失为一种比较可取的辅助治疗手段，而DC-CIK细胞将成为首选方案。该疗法可单独用于治疗，也适宜作为手术或放化疗后的辅助疗法，以提高疗效和改善生存质量。因此，该法已成为肿瘤治疗的手段之一，为预防肿瘤复发、消除患者体内残留的肿瘤细胞、改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的治疗途径。

[参考文献]

[1]尤渺宁，任军，邱立军，等.树突状细胞体腔回输治疗恶性体腔积液的疗效观察及护理[J].护士进修杂志，2013，28（1）：87-88.

[2]于卉影，孙英慧，蔺迪，等.肿瘤患者自体CIK细胞输注增强再次制备时CD3+CD56+细胞的体外扩增能力[J].细胞与分子免疫学杂志，2014，30（7）：748-753.

[3]王睿斌，郝筱诗，齐保聚，等.晚期直肠癌患者DC-CIK免疫干预前后D二聚体改变的临床研究[J].2014，18（2）：247-250.

[4]匡幼林，邓远忠，梁思敏，等树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞抗前列腺癌细胞的免疫效应[J].重庆医学，2014，43，（17）：2167-2169.

[5]龚奕，陈幸华，张曦，等.DC-CIK细胞输注治疗急性髓细胞白血病50例分析[J].重庆医学，2011，40（30）：3039-3041.

[6]刘苗，金润铭，姜毅.树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞生物学特性和体外杀瘤机制[J].实用儿科临床杂志，2011，26（1）：35-38.

[7]WangQJ，WangH，PanKetal.Comparativestudyonanti-tumorimmuneresponseofautologouscytokineinducedkiller（CIK）cells，dendriticcells-CIK（DC-CIK）andsemi-allogeneicDC-CIK[J].Cancer，2010；29（7）：641-647.

[8]LinnYG，HuiKM.Cytokine-inducedkillers：NK-likeTcellswithcytotolyticspecificityagainstleukia[J].LeukLymphoma，2003（44）：1457-1462.

[9]曲佳，詹星，冯可欣，等.冬凌草甲素联合DC-CIK细胞杀伤RPMI8266细胞的研究[J].实用医学杂志，2014，30（14）：2208-2210.

细胞研究范文

【关键词】干细胞肝进展

目前肝移植是各类终末期肝病的主要治疗方法。但由于供肝的严重缺乏，大大限制了其广泛应用，很多患者因得不到供肝而死亡。肝细胞移植在等待肝移植的过程中起到桥梁作用，为实现肝移植带来希望。但由于可用于移植的肝细胞数量不足，加之移植后分裂次数少等原因使其纠正肝功能的作用有限，而干细胞的出现恰恰解决了这一难题。干细胞是一类能自我复制增殖并具有分化为多种类型细胞潜能的细胞群，能根据需要通过控制条件使其分化为需要的、代替受损的或病态的细胞，较肝细胞有更小的免疫排斥反应，可更好地达到恢复器官功能、治愈疾病的目的。对肝干细胞的研究已进入临床前期和临床试验阶段，具有重大临床意义和应用前景。

1肝干细胞的分类

1.1胎肝细胞胎肝细胞是胚胎时期分裂形成肝脏的前体细胞，较成熟肝细胞具有更大的增殖潜能。Dabeva等［1］对14d大鼠胎肝的细胞类型分析发现了一类细胞同时表达肝细胞和胆管细胞标志，可以分化为肝细胞或胆管细胞，因此被认为是肝干细胞的胚胎来源。Dan等［2］从74～108d人胎肝中分离得到的人胎肝多潜能祖细胞，体外培养，具有强增殖力，并可分化为肝细胞、胆管上皮细胞、脂肪细胞等其他组织来源的细胞，在移植入肝病动物模型后可分化为有功能的肝细胞并长期存活。由于胎肝细胞易于大量分离培养，因此是很好的移植细胞供体，但由于来源涉及伦理问题限制了其临床应用。

1.2成体肝内干细胞对成体肝内干细胞的研究已取得较大进展，已成功分离、培养并移植。其中Farber在研究动物肝癌模型时发现的肝卵圆细胞是最早发现并被认可的一类肝干细胞，其形态特征是细胞小，仅6～8μm，核大，呈卵圆形，核/质比例大，胞质内细胞器少，含少量线粒体和粗面内质网，核内有凝聚的染色质，可同时表达肝细胞和胆管细胞的表面标志如CK-7、CK-8、CK-18和CK-19等。Petersen等［3］发现A6阳性的肝卵圆细胞也表达Thy-1、sca-1、CD34和CD45等造血干细胞标志。2006年Davies等［4］利用永生化卵圆细胞系PIL-2研究发现环氧合酶COX-2抑制剂SC-236可以诱导卵圆细胞数量减少。同年Suzuki等［5］研究发现IL-15可以明显上调卵圆细胞的累积，增加肝再生能力。最近Szabo等［6］在研究肝再生模型时发现肝卵圆细胞表达Matrilin-2，认为是一种新的卵圆细胞标志。而Jelnes等［7］在研究不同类型的肝再生模型时发现卵圆细胞具有明显的异质性。除卵圆细胞外在成体肝内还发现了其他的肝干细胞。Mitaka等［8］从成体大鼠肝内分离到与卵圆细胞类似的细胞，称为“小肝细胞”，大小是成熟肝细胞的1/3～1/2，呈单核、低分化形态，在培养中形成克隆并分化为有功能的成熟肝细胞。Fujikawa等［9］从成体小鼠肝内分离甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），AFP阳性细胞具有未分化内胚层细胞的特征，体外培养可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞。Khuu等［10］在人原代肝细胞培养时发现肝上皮细胞表达肝细胞、胆管细胞和干细胞的标志，认为是另一种人肝干细胞。Cerec等［11］从人HepaRG细胞群中分离到了具有双向潜能的肝干细胞，体外培养可以分化为肝细胞样和胆管细胞样细胞，认为也是一种肝内干细胞。

1.3骨髓来源的干细胞很多学者认为造血干细胞可以作为肝干细胞的肝外来源。Avital等［12］研究证实从骨髓分离的造血干细胞移植入受体后，可整合到受体肝板，分化为成熟肝细胞并合成尿素。Harris等［13］以绿色荧光蛋白报告基因转染干细胞并进行性别交叉移植实验，发现分化的肝细胞没有表达荧光蛋白，且仍为双倍体，进一步证实了骨髓造血干细胞可横向分化为肝细胞。而Grompe［14］认为骨髓来源的肝细胞是通过细胞融合而不是分化为肝细胞。而Oh等［15］研究发现在一定生理条件下，一部分肝细胞可以来自骨髓，没有发生细胞融合。除骨髓造血干细胞外，骨髓间充质干细胞、基质干细胞也被认为是肝干细胞的来源。

1.4其他肝外干细胞目前从许多肝外组织中如胰腺、唾液腺、羊膜和真皮中均发现了可以分化为肝细胞的干细胞。另外胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）由于具有多潜能，且可以分化为各种细胞，所以也被认为是肝干细胞的来源之一。

2肝内干细胞的定位和来源

2.1定位由于缺乏特异性标志物，卵圆细胞在肝脏中的定位较为困难。干细胞主要位于汇管区、纤维隔和终末胆管树即赫氏管周围。肝脏祖细胞位于门脉周围及整个肝小叶。Burke等［16］认为卵圆细胞存在于门周区和肝实质内。

2.2来源肝干细胞与胚胎时期的原始肝内胆管一样均表达肝细胞和胆管细胞的表面标志，因此原始肝内胆管细胞可能是成体肝卵圆细胞的祖细胞。Avital等［12］证实灵长类动物胎肝中存在具有双重表现型的原始肝脏上皮细胞，在体外表达白蛋白、AFP的肝细胞和表达CK-7、CK-19的胆管细胞，因此认为成体肝脏内干细胞是胚胎时期胎肝中的干细胞的遗留。也有许多学者认为骨髓是肝内干细胞的来源之一，并且在一定条件下如肝损伤时可向肝内运输补充干细胞池，参与肝损伤的修复［17］。

3临床前期研究

3.1肝干细胞的分离纯化培养因为干细胞数量较少，想分离肝干细胞，首先要使其大量增生，需要建立肝干细胞增殖模型。最早是1977年SoltD和FarberE建立的Solt-Farber模型。1983年Solt等［18］对此模型进行了改良，即目前最常用的肝卵圆增殖模型。另外用乙硫氨酸、N-乙酰对氨基酚、倒千里光碱、Dipin和D-半乳糖胺等均建立了肝卵圆细胞增殖模型。Ise等［19］结扎大鼠的70%的门静脉也获得了肝干细胞增殖模型。Gordon等［20］利用两步胶原酶法从大鼠分离得到小肝细胞。Nakauchi［21］采用FACS法从13.5d小鼠胎肝内分离得到表达C-MetCD49fc-kitcd45Ter119的肝干细胞。2005年Stamp等［22］使用免疫磁珠分离法和单克隆抗体GCTM-5从人胎肝中分离到人肝胚细胞和肝胆上皮细胞亚群。荧光活化细胞法和免疫磁珠法均需要特异性抗原和抗体，由于目前还未发现肝卵圆细胞的确切表面标志，此类方法仍需改进。肝干细胞的体外培养较困难，因为在体外干细胞很容易自身分化为肝细胞而失去增殖能力，目前的研究发现生长因子、细胞外基质和饲养层有利于干细胞的体外培养。Suzuki等［5］利用层黏连蛋白包被培养板并加入肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF，50ng/mL）获得了干细胞体外培养细胞克隆。Monga等［23］在培养液中加入HGF、SCF、Flt-3后培养发现肝干细胞可大量增殖，而He等［24］在培养板中加入PREF即成纤维细胞饲养层，结果有饲养层的培养板中肝干细胞增殖明显并保持未分化状态3个月，而无饲养层的培养板中肝干细胞很快分化。

3.2肝干细胞移植肝干细胞移植借鉴了肝细胞移植的方法。Kusano等［25］认为在肝脏未发生较大结构破坏时是最佳移植部位，而当肝脏严重受损时不利于干细胞的成活，需要异位移植。而在所有肝外器官中脾脏是肝细胞的最佳部位。移植方式以经门静脉注入干细胞和脾内注射两种方法最为常用。Avital等［12］用骨髓干细胞悬液经近侧门静脉注入，发现干细胞在肝脏内增殖状况良好。Matsusaka等［26］采用夹闭脾门处静脉将干细胞悬液注入脾内，然后结扎门静脉左支的方法增加细胞在脾内着床的机会。Fang等［27］在将干细胞移植入肝硬化小鼠的肝脏内发现肝损伤程度减轻，并且移植的干细胞分化为肝细胞并表达白蛋白。Kashofer等［28］将纯化的造血干细胞移植入I型酪氨酸血症模型大鼠体内，重建了肝脏的生化功能，缓解了病情。最近，Yu等［29］报道将表达HGF的间充质干细胞植入大鼠肝移植模型后发现植入的干细胞与受体肝融合并分泌白蛋白，表明干细胞移植可以改善肝再生。

4临床研究

目前研究最多的是骨髓造血干细胞和外周血干细胞自体移植。2002年Kumar等［30］报道，对1例原发性淀粉样变患者肝移植术后淀粉样变复发实施自体骨髓干细胞移植，28个月后发现其症状体征明显改善。2006年Arai等［31］报道，对43例暴发性肝衰竭（fulminanthepaticfailure，FHF）患者和45例急性自限性肝炎（acuteself-limitedhepatitis，AH）患者进行血OPN（osteopontin）检测比较，发现FHF平均血OPN水平高于AH患者（P=0.003），而且OPN高的患者预后较差。同年Tsamandas等［32］对77例丙型肝炎的肝活组织检查标本分析发现肝祖细胞（hepaticprogenitorcell，HPC）的表达与疾病的严重程度呈正相关，并由此提出HPC的生长和增殖可以作为预后的一项重要指标。Katoonizadeh等［33］对74例急性亚急性重症肝损伤患者的肝活组织检查进行分析发现，组织中增生肝细胞和HPC的比例与临床肝损伤程度呈正相关，肝细胞损失和HPC活化较少，而成熟肝细胞大量增生的活组织检查标本的患者生存率较高。Gupta等［34］报道，对12例先天性肝硬变患儿行自体干细胞移植，5例因肝硬变进展死亡，7例存活，其中4例胆管炎消失，5例有黄便，3例肝硬变硬度减轻，6例肝功能改善，6例食欲提高，肝胆管扫描4例胆汁排泄改善，病理学组织检查示3例肝硬变改善，再次证实了干细胞移植治疗肝硬变的临床效果。

5前景与展望

肝干细胞的研究已经在动物模型和临床研究中取得了部分成功，为最终治愈肝脏疾病开辟了新的研究方向。尽管还有很多问题尚未解决，如：肝干细胞确切的特异性标志，更成熟的干细胞分离、纯化、鉴定、体外培养技术，干细胞的确切增殖分化机制，如何防止其癌变等，但越来越多的成功报道已经向世人展示了其广阔而美好的应用前景，为临床治疗终末期肝病带来了新的曙光。

参考文献

[1]DabevaMD，PetkovPM，SandhuJ，etal.Proliferationanddifferentiationoffetalliverepithelialprogenitorcellsaftertransplantationintoadultratliver[J].AmericanJournalofPathology，2000，156（6）:2017-2031.

[2]DanYY，RiehleKJ，LazaroC，etal.Isolationofmultipotentprogenitorcellsfromhumanfetallivercapableofdifferentiatingintoliverandmesenchymallineages[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103（26）:9912-9917.

[3]PetersenBE，GoffJP，GreenbergerJS，etal.HepaticovalcellsexpressthehematopoieticstemcellmarkerThy-1intherat[J].Hepatology，1998，27（20）:433-445.

[4]DaviesRS，KnightB，TianYW，etal.Hepaticovalcellresponsetothecholine-deficient，ethioninesupplementedmodelofmurineliverinjuryisattenuatedbytheadministrationofacyclo-oxygenase2inhibitor[J].Carcinogenesis，2006，27（8）:1607-1616.

[5]SuzukiA，McCallS，ChoiSS，etal.Interleukin-15increasehepaticregenerativeactivity[J].JHepatol，2006，45（3）:410-418.

[6]SzaboE，LodiC，KorposE，etal.Expressionofmatrilin-2inovalcellsduringratliverregeneration[J].MatrixBiol，2007，26（7）:554-560.

[7]JelnesP，Santoni-RugiuE，RasmussenM，etal.Remarkableheterogeneitydisplayedbyovalcellsinratandmousemodelsofstemcell-mediatedliverregeneration[J].Hepatology，2007，45（6）:1462-1470.

[8]MitakaT，KojimaT，MizuguchiT，etal.Growthandmaturationofsmallhepatocytesisolatedfromadultratliver[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，1995，214（2）:310-317.

[9]FujikawaT，HiroseT，FujiiH，etal.Purificationofadulthepaticprogenitorcellsusinggreenfluorescentprotein（GFP）-transgenicmiceandfluorescence-activatedcellsorting[J].JHepatology，2003，39（2）:162-170.

[10]KhuuDN，NajimiM，SokalEM.Epithelialcellswithhepatobiliaryphenotype:isitanotherstemcellcandidateforhealthyadulthumanliver[J].WorldJGastroenterol，2007，13（10）:1554-1560.

[11]CerecV，GlaiseD，GarnierD，etal.Transdifferentiationofhepatocyte-likecellsfromthehumanhepatomaHepaRGcelllinethroughbipotentprogenitor[J].Hepatology，2007，45（4）:957-967.

[12]AvitalI，FeraressoC，AokiT，etal.Bonemarrow-derivalliverstemcellandmaturehepatocyteengraftmentinliversundergoingrejection[J].Surgery，2000，132:384-390.

[13]HarrisJR，BrownGA，JorqensenM，etal.Bonemarrow-derivedcellshometoandregenerateretinalpigmentepitheliumafterinjury[J].InvestOphthalmolVisSci，2006，47（5）:2108-2113.

[14]GrompeM.Theroleofbonemarrowstemcellsinliverregeneration[J].SeminLiverDis，2003，23（4）:363-372.

[15]OhSH，WitekRP，BaeSH，etal.Bonemarrow-derivedhepaticovalcellsdifferentiateintohepatocytesin2-acetylaminofluorene/partialhepatectomy-inducedliverregeneration[J].Gastroenterology，2007，132（3）:1077-1087.

[16]BurkeZD，ShenCN，RalphsKL，etal.Characterizationofliverfunctionintransdifferentiatedhepatocytes[J].JCellPhysiol，2006，206（1）:147-159.

[17]LagasseE，ConnorsH，Al-DhalimyM，etal.Purifiedhematopoieticstemcellscandifferentiateintohepatocytesinvivo[J].NatMed，2000，6（11）:1212-1213.

[18]SoltDB，CayamaE，TsudaH，etal.Promotionoflivercancerdevelopmentbybriefexposuretodietary2-acetylaminofluorenepluspartialhepatectomyorcarbontetrachloride[J].CancerRes，1983，43（1）:188-191.

[19]IseN，SatoT，YasuiO，etal.Enhancedproliferationofheaticprogenitorcellsinratsafterportalbranchocclusion[J].LiverTranspl，2004，10（6）:748-754.

[20]GordonGJ，ButzGM，GrishamJW，etal.Isolation，short-termculture，andtransplantationofsmallhepatocyte-likeprogenitorcellsfromretrrisine-exposedrats[J].JTransplantation，2002，73（8）:1236-1243.

[21]NakauchiH.Isolationandclonalcharacterizationofhematopoieticandliverstemcells[J].Cornea，2004，23（8Suppl）:S2-7.

[22]StampL，CrosbyHA，HawesSM，etal.Anovelcell-surfacemarkerfoundonhumanembryonichepatoblastsandasubpopulationofhepaticbiliaryepithelialcells[J].StemCells，2005，23（1）:103-112.

[23]MongaSP，TangY，CandottiF，etal.Expasionofhepaticandhematopoieticstemcellutilizingmouseembryonicliverexplants[J].JCellTransplant，2001，10（1）:81-89.

[24]HeZP，TanWQ，TanqYF，etal.Activation，isolation，identificationandinvitroproliferationofovalcellsfromadultratlivers[J].CellProlif，2004，37（2）:177-187.

[25]KusanoM，MitoM.Observationsonthefinestructureoflongsurvivedhepatocytesinoculatedintoratspleen[J].Gastroenterology，1982，82:616-628.

[26]MatsusakaS，ToyosakaA，NakashoK，etal.Theroleofovalcellsinrathepaticytetransplantation[J].Transplantation，2000，70:441-446.

[27]FangB，ShiM，LiaoL，etal.SystemicinfusionofFLKI（+）mesenchymalstemcellsamlioratecarbontetrachloride-inducedliverfibrosisinmice[J].Transplatation，2004，78（1）:83-88.

[28]KashoferK，BonnetD.Genetherapyprogressandprospects:stemcellplasticity[J].GeneTher，2005，12（16）:1229-1234.

[29]YuY，YaoAH，ChenN，etal.Mesenchymalstemcellsover-expressinghepatocytegrowthfactorimprovesmall-for-sizelivergraftsregeneration[J].MolTher，2007，15（7）:1382-1389.

[30]KumarKS，LefkowitchJ，RussoMW，etal.SuccessfulsequentialliverandstemcelltransplantationforhepaticfailureduetoprimaryALamyloidosis[J].Gastroenterology，2002，122（7）:2026-2031.

[31]AraiM，YokosukaO，KandaT，etal.Serumosteopontinlevelsinpatientswithacuteliverdysfunction[J].ScandJGastroenterol，2006，41（1）:102-110.

[32]TsamandasAC，SyrokostaI，ThomopoulosK，etal.PotentialroleofhepaticprogenitorcellsexpressionincasesofchronichepatitisCandtheirrelationtoresponsetotheropy:aclinicopathologicstudy[J].LiverInt，2006，26（7）:817-826.

细胞研究范文篇3

1脂肪细胞的来源

脂肪细胞起源于脂肪组织中存在的问充质干细胞，与骨髓基质中存在的干细胞一样，该细胞因具有自我更新、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征而被称为脂肪源性干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)。Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞形态相似，称之为脂肪干细胞(ADSCs)，平均每300ml脂肪组织可获得2×108～6×108个这样的细胞。ADSCs不像骨髓间充质干细胞对培养基中胎牛血清的来源有严格的要求，在加入任何批号胎牛血清的DMEM培养基中都能分化成脂肪细胞。此外，骨髓问充质干细胞也可分化为脂肪细胞。Mauney等将MSCs孵育在含有10％胎牛血清、lO％正常大鼠血清、10-％ol／L的地塞米松，5ug／ml胰岛素的a-MEM培养基中，2天后撤去地塞米松，继续9呼育5～7天后，MSCs分化成为脂肪细胞。

ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、CD70、CD105／SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45。为阴性反应。ADSCs有两个特征性表达分化抗原CD49d和CD。∞，前者肯定存在而后者肯定没有，与MSCs情况相反。

2脂肪细胞分化过程及其形态变化

能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化为单能干细胞，即脂肪母细胞，它保持着干细胞增殖活跃的特性。脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，也是通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合，接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为多能干细胞一脂肪母细胞一前脂肪细胞一不成熟脂肪细胞一成熟脂肪细胞。

生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积。以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“0”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。

3脂肪细胞分化的分子标志

3．1早期标志

3．1．1脂蛋白脂酶(LPL)：LPL是一个60kD的糖蛋白，在前脂肪细胞阶段即有表达，并随分化表达逐渐增加，到分化晚期趋于稳定。LPL在能量代谢和脂质积聚中发挥重要作用，但由于ADSCs在分化为前脂肪细胞时缺少LPL的表达，因此LPL已成为脂肪细胞分化的重要因子，是干细胞分化为前脂肪细胞的经典标志。

3．1．2前脂肪细胞因子(pref－1)：pref-l为跨膜蛋白，其胞外有6个连续的表皮生长因子样结构域。与LPL截然不同，pref-l是脂肪细胞分化早期具有抑制作用的因子。pref-1的持续高表达可明显抑制脂肪细胞的分化。有研究表明[6]pref一1可能抑制p42／p44MARK通路，阻断胰岛素样生长因子受体的信号传递，从而抑制脂肪细胞分化。

3．2晚期标志：脂肪细胞进入终末分化阶段，晚期标志开始出现。主要包括：①甘油三酯代谢相关的酶类，如乙酰辅酶A脱羧酶，甘油三磷酸脱氢酶，脂肪酸合成酶等；②激素相关蛋白，如胰岛素敏感性葡萄糖转运蛋白，胰岛素受体等；③成熟脂肪细胞特异产物，如脂肪细胞脂结合蛋白，脂肪酸转运蛋白，脂联素(acrp30)和抵抗素(resitin)。上述因子中，尤其以后两者备受关注。acrp30是30kD的分泌性蛋白，重组acrp30可显著降低肥胖动物体内的血糖和游离脂肪酸，增强脂肪氧化，减轻体重和胰岛素敏感性，由此提示acrp30可能是肥胖及胰岛素抵抗发生中的重要保护因子。抵抗素的N端为信号肽，它是晚期分化的特异信号分子，重组抵抗素能使正常小鼠出现胰岛素抵抗症状，而其抗血清却能够改善胰岛素抵抗症状，因此，有学者认为抵抗素是联系胰岛素抵抗与肥胖之间的纽带，此观点还需进一步考证。

4脂肪细胞分化的基因调控

脂肪细胞分化过程中有大量的基因表达。主要有C／EBPs家族，PPARs家族，还有螺旋一环一螺旋转录因子家族等其他转录因子。其中以前两者研究的最多。

4．1C／EBPs家族：C／EBPs家族因其具有激活特定基因DNA增强子CAAT重复序列的功能也被称为CAAT／增强子家族。它包括C／EBPa、B、6三个成员，这三个成员分别在细胞分化过程中按一定时序规律地表达[9]。C／EBPB、6最先表达于前脂肪细胞，受诱导剂作用于分化早期短暂表达增高，并协同促进PPAR-Y和C／EBPQ的表达。c／EBPQ的表达则相对较晚，受C／EBPB、6和PPAR-Y的调节后，通过脂肪细胞特异基因的表达，促进脂肪细胞进入终末分化阶段。

4．2PPARs家族：PPARs家族为II型核受体超家族，主要有a、B、Y、6四个亚型，与配体结合后与视黄酸类受体形成异二聚体，结合于靶基因启动子上游的过氧化物酶增殖体反应元件而发挥转录调控作用。其中，PPAR―Y的作用较为突出，PPAR-Y可通过调节转录因子CAAT／增强子结合蛋白a、脂代谢关键酶或转运蛋白、脂肪细胞分泌蛋白表达，影响脂肪细胞分化进程。因此，PPAR-Y被誉为脂肪细胞分化的内在调定点。

4．3螺旋一环一螺旋转录因子家族：螺旋一环一螺旋转录因子家族有两个成员，它们分别是脂肪细胞决定和分化依赖因子l(ADDl)和固醇调节元件结合蛋白1(SREBPl)。二者可独立作为转录因子调节脂肪细胞的分化和胆固醇的转录。

其他与脂肪形成有关的转录因子还包括孤束核受体RORY和ERRa、各种STAT蛋白，它们可能具有诱导和维持终末分化的功能，但对此功能尚未进行深入的研究。

5脂肪细胞的功能

脂肪组织过去只被看作是能量的贮存库或组织器官问的填充材料，随着脂肪细胞的分泌因子被

人们发现，脂肪细胞的其他重要功能也被逐渐发掘出来。脂肪组织可以分泌多种生物活性物质一脂肪因子，这些因子作用于中枢神经系统、免疫系统及内分泌器官，如垂体、性腺、甲状腺和内分泌胰腺，参与神经、内分泌、免疫网络和组织损伤的修复。

5．1脂肪细胞的分泌功能：脂肪细胞具有多种内分泌、旁分泌及自分泌功能。现已发现人脂肪细胞能分泌100多种脂肪细胞因子(adipocytokines)，对全身各器官，也包括脂肪组织本身具有重要的调节功能。在这些脂肪因子中，研究比较多的有瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子(TNFa)、白细胞介素(IL)～lb、IL-6、IL-8、IL―10、IL-18、网膜素、纤溶酶原激活物抑制物一1、肝磷脂结合上皮生长因子样生长因子和血管紧张素等。其中脂联素是脂肪细胞表达最丰的激素，它通过内分泌、旁分泌及自分泌作用于肝脏、脑、骨骼肌、血管及脂肪组织自身，调节能量代谢、抗炎及抗动脉粥样硬化。抵抗素在2001年被发现，并以其诱导胰岛素抵抗的效应而被命名。1985年，TNFa被检出为炎性因子，1993年发现它也为脂肪因子。TNFa诱导胰岛素受体底物一l(IRS-1)丝氨酸的磷酸化，既诱导胰岛素抵抗，同时也诱导胰岛B细胞的凋亡。血液循环中的IL-6有25％由皮下脂肪组织分泌，其免疫调节功能甚为重要。2005年最新报道的网膜素有提高胰岛素处置葡萄糖的效应，而内脂素则独立于胰岛素而又有类似胰岛素的作用。

最近，Fukuhara等利用DD-PCR技术发现了又一新的脂肪因子，命名为内脏素，序列分析显示内脏素即为前B细胞克隆增强因子(PBEF)。人PBEF由473个氨基酸组成，分子量约52kD。该分子缺乏经典的分泌性蛋白信号肽序列。目前已知的PBEF功能有：①在B细胞发育的早期，PBEF可增强干细胞因子和IL-7的促前B细胞克隆形成，在B细胞的分化与成熟中发挥重要作用；②PBEF具有抗凋亡作用；③PBEF具有烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosytran-ferase，NAmPRTase)的活性，参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的合成；④PBEF是与细胞周期相关的蛋白；⑤与分娩有关等。

上述这些因子分别和内分泌神经中枢、肾上腺、胰岛、骨骼肌、肝脏、心肌及血管内皮等细胞进行脂一脑、脂一胰、脂一肌及脂一肝等的对话，形成复杂反馈网络，以维持糖脂代谢，调节血管内皮功能以及机体的免疫功能等。

5．2脂肪细胞的创伤修复功能：瘦素通过刺激JNK信号转导途径促发转录蛋白活性，并将细胞外刺激信号转导入细胞核内，通过细胞外信号调节激酶磷酸化，使伤口边缘角质形成细胞的增殖能力明显增强。除了瘦素外，脂肪细胞分泌的TNF-a、IL-6及IL-8等也参与创伤修复中的炎症介导反应。纤溶酶原激活物抑制物－1、血管紧张素原、性激素类(特别是雌激素)、视黄醇结合蛋白质、脂蛋白脂酶、抵抗素和游离脂肪酸等都与创伤修复有关。

5．3脂肪细胞的免疫功能：瘦素可以刺激人外周T淋巴细胞活化和增殖，促使细胞表面活化标记膜分子在T淋巴细胞上表达，受刺激后的T淋巴细胞产生更多的Thl细胞因子如IL-22、干扰素一Y，使T细胞向Thl细胞分化。瘦素还可体外诱导单核细胞表达促炎细胞因子IL26和TNF-a，从而活化淋巴细胞，诱导巨噬细胞表达粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、G-CSF，刺激粒细胞的功能。

瘦素和脂联素还可刺激脂肪组织本身分泌IL-1B、IL-6、TNF-a和前列腺素－2释放，该作用可被抗炎因子RKl／2促分裂原活化蛋白激酶抑制因子U0126、PPAR―y配体曲格列酮和NF―KB抑制剂BAY11-7082抑制鉴于瘦素的免疫功能，有人提出将瘦素作为免疫治疗的新靶点。

6脂肪细胞的凋亡