干细胞治疗范文

目的分别观察骨髓单个核细胞复合异种骨、骨髓基质干细胞复合异种骨以及单独植入异种骨对兔坏死股骨头的修复效果，并对其进行比较，以判定骨髓骨髓单个核细胞是否对股骨头坏死有修复作用。方法23只新西兰白兔，用液氮冷冻的方法，建立双侧股骨头坏死模型，取其中45个坏死股骨头，随机分组，分别为对照组，实验1组，实验2组。每组15只股骨头。对照组为髓芯减压后单独的异种骨植入，实验1组为髓芯减压后植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组为髓芯减压后植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。术后2、4、8周，分别行x线检查、masson染色检查、及新生血管面积百分比和新生骨小梁体积百分比统计分析。结果纳入新西兰白兔23只，均进入结果分析。x线及masson染色检查示实验1、2组修复效果相同，均优于对照组。术后新生血管面积百分比和股骨头新生骨体积百分比比较，同时期实验组效果好于对照组，且统计学差异明显。而实验1、2组间除2、4周血管面积百分比外，其余都无显著性差异。结论骨髓单个核细胞确有修复坏死股骨头的效果，且与骨髓基质干细胞修复效果相似。

【关键词】骨髓单个核细胞骨髓基质干细胞异种骨股骨头坏死

abstract:objectivetoobserveandcomparetherespectiveeffectsofbonemarrowmononuclearcellscompositebonexenograft,bonemarrowstromalcellscompositebonexenograftandbonexenograftonrestorationofcaputfemorisnecrosis.methodsthecaputfemorisnecrosismodelswereestablishedin23rabbitswithbilateralcaputfemorisnecrosis,and45necroticcaputfemoriswererandomlydividedinto3groupswith15necroticcaputfemorisineachgroup.onegroupservedascontrolgroupwithimplantationofbonexenograft,anothergroupasexperimentalgroup1withimplantationofmarrowstromalcellscompositebonexenograft,andthelastgroupasexperimentalgroup2withimplantationofbonemarrowmononuclearcellscompositebonexenograft.after2,4and8weeks,x-rayexaminationandmassontrichromestainingexaminationwererespectivelytaken,andalkalinephosphataseactivitieswasrespectivelyanalyzed,andthestatisticalanalysisofpercentageofnewveinareaandpercentageofnewbonetrabeculawerealsorespectivelycarriedout.resultsallthe23rabbitswereinvolvedintheresultanalysis.theresultsofx-rayexaminationandmassonstainingexaminationshowedthattheeffectsofthetwoexperimentalgroupswerebetterthanthoseofthecontrolgroup.alkalinephosphataseactivitiesanalysis,statisticsofpercentageofnewveinareaandpercentageofnewbonetrabeculaallindicatedthatinthesameperiodoftime,theeffectsofthetwoexperimentalgroupswerebetterthanthoseofthecontrolgroup,andthestatisticaldifferencesweresignificant.buttherewerenosignificantdifferencesbetweenthetwoexperimentalgroupsinallaspects,exceptthepercentageofnewveinareaafter2and4weeks.conclusionsbonemarrowmononuclearcellscompositebonexenograftcanrestorecaputfemorisnecrosis,andnearlyhavethesameeffectsasbonemarrowstromalcells.

keywords：bonemarrowmononuclearcells;bonemarrowstromalcells;bonexenograft;caputfemorisnecrosis

股骨头坏死的治疗仍是国内外的一大难题，对其的研究也是骨科研究中一个活跃的热点。近年来骨组织工程研究快速发展，其在股骨头坏死的治疗方面也有了充分的利用。全骨髓复合载体或者骨髓基质干细胞复合载体［1］等都被应用于股骨头坏死的治疗。但是全骨髓复合载体治疗股骨头坏死疗效不确切。骨髓基质干细胞复合载体，虽然疗效确切，方法却比较烦琐，容易发生污染。我们本次研究的骨髓单个核细胞，是将全骨髓离心，去除其中的血浆和红细胞后，获得的一种混合物质，其中的骨髓基质干细胞比例较全骨髓有很大提高。同时还包括了一些促进修复的因素。通过本次实验中，我们分析骨髓单个核细胞对股骨头坏死的修复作用，同时探讨单个核细胞复合异种骨治疗股骨头坏死的能力。为临床治疗股骨头坏死探索一种新的方法。

1材料和方法

1.1材料实验于2004年9月至2005年1月，在辽宁医学院附属第一医院外科实验室完成。实验动物为新西兰白兔23只，雌雄不限，由锦州医学院动物实验中心提供，体重2.5～3.0kg，建立双侧股骨头坏死模型，取其中45只股骨头用于实验，随机分为3组，分别是对照组，实验1、2组，每组15只股骨头，对照组为髓芯减压后单独的异种骨植入，实验1组为髓芯减压后植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组为髓芯减压后植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。

1.2方法依照赵宝全的方法［2］。

骨髓基质干细胞的培养及复合载体：参考赵子义等［3］的方法，采用全骨髓培养法分离和培养骨髓基质干细胞。制成细胞悬液，按1∶3传代。之后仍每3天换液1次，待细胞再次长满瓶底，收集骨髓基质干细胞悬液，并离心后，将其配成6×106个/ml的细胞悬液，无菌条件下，将其逐滴滴至松质骨上，使之充分渗入孔隙,等待植入。

单个核细胞的提取及复合载体：速眠新肌注麻醉实验用兔后，消毒，在股骨大转子、胫骨结节等处用穿刺针及肝素化的注射器抽取骨髓，共8ml。混合等体积的dmem培养基后，吹打成细胞悬液，用密度为1.073g／lpercoll分离液提取单个核细胞，要求将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含有提取液的离心管，使悬液置于提取液上层，于离心机1500r／min离心20min，取云雾状中层即骨髓单个核细胞,约1ml，无菌条件下，将离心所得单个核细胞逐滴滴至松质骨上，使之充分渗入孔隙。等待植入。

股骨头坏死模型的制备及修复实验：新西兰白兔术区备皮，手术台俯卧位固定，速眠新肌注麻醉下，取髋关节外侧斜形切口，长约4cm，切开皮肤、皮下、深筋膜，分开臀中肌，显露髋关节囊，t型切开关节囊，可见股骨头外上部分。不切断圆韧带，内收下肢，增加股骨头暴露部分。后在保护股骨头周围组织的情况下，用棉棒反复沾取液氮，持续紧贴股骨头3min。再用温生理盐水复温1分钟。随后从股骨头基底向液氮冷冻部钻孔，直达软骨下2mm，形成一直径3.5mm的腔隙。对照组将单独的异种骨植入，实验1组植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。完成处理后，逐层关闭切口。术毕分笼饲养，肌注青霉素40万u／d，持续5天。所有实验用兔，统筹安排，选取适当手术和处死时间，处死后，先行影像学检查，再取股骨头做其他检查。

1.3主要观察指标

x射线检查：术后2，4，8周，处死实验用兔取俯卧位摄髋关节正位片。观察股骨头密度变化，判断修复效果。

masson染色：术后2，4，8周取股骨头，冠状切开，10％福尔马林固定1周、5％硝酸脱钙3天，石蜡切片，7μm厚度，后按说明逐步完成masson染色。最后光镜下观察坏死股骨头修复情况。

新生血管面积百分比：取实验组织块，连续切片，从第10张开始选片，每隔50张选1张，每个组织选5张。在每张切片的原冷冻坏死修复区域，随机选取5个100倍视野，用计算机图像分析系统进行分析，计算各个平面，新生血管占修复区面积的百分比。

新生骨体积百分比：取上述切片，在每张切片的原冷冻坏死修复区域，随机选取5个100倍视野，根据weibel点计数法及立体学公式，vv=∑po/∑pα，以骨组织为参照空间，对各实验组和对照组坏死修复区进行定量，每个视野通过对点的计数来统计修复比例。计算公式中∑po为落在修复区的点数，∑pα为镜下的总点数。

1.4统计学分析

应用spss11.0软件进行统计学分析，数据全部以均数±标准差（±s）表示。各个时间段，3组间的数据分别进行两两比较，又称多重比较，故使用多样本的单因素方差分析，p＜0.05认为有统计学差异。

2实验结果

2.1x线检查

术后2周，关节间隙正常，股骨头外形正常，对照组股骨头内局部可见囊性改变，边缘少量密度增高影。实验组可见斑片样或云絮样密度增高影，且实验1组密度增高影又多于实验2组。术后4周，对照组股骨头局部刚可见云絮样密度增高影，而实验组密度整体呈均匀增高，两实验组间无明显差异。术后8周实验组股骨头密度增高显著，且两实验组x片无明显差别(图1)，对照组密度增高不如实验组增高明显，且不完全均匀（图2）。

2.2masson染色

新生骨小梁呈蓝色，红细胞及成熟骨小梁呈红色，细胞核呈蓝褐色。

术后2周，对照组可见少量新生血管和细小新生骨小梁。骨小梁蓝染为主，且不均匀，骨陷窝周围蓝染较深，骨小梁局部点缀红染。骨小梁间为纤维结缔组织充填，可见少量新生血管。实验1组骨小梁染色蓝色为主，但处处可见红染，骨小梁间可见大量活跃的成骨细胞。实验2组骨小梁染色蓝色为主，但红染较对照组多，骨小梁间为纤维结缔组织充填，数条血管也见于骨小梁间。

术后4周，对照组骨小梁较细小且数量少，骨小梁蓝染仍不均匀，局部可见少量红染部分，骨小梁边缘可见少量成骨细胞。实验1组，骨小梁局部蓝染均匀，出现片状红染，骨小梁边缘骨髓基质干细胞活跃，骨小梁间纤维组织为主，血管丰富，有少量新生骨髓组织。实验2组骨小梁可见条状蓝染，片状红染，骨小梁间血运丰富，可见新生骨髓组织。

术后8周，对照组（图3）骨小梁红染增多，但仍以蓝染为主。骨小梁边缘可见部分静止成骨细胞，小梁间可见丰富骨髓组织。实验1、2组（图4、5）可见成熟骨小梁，整个骨小梁多数红染，骨小梁排列有序。小梁间可见丰富骨髓组织。两实验组间未见明显差别。

2.3新生血管面积百分比统计分析

术后2、4、8周计算机图像采集，并计算不同时期各个冠状切面新生血管占坏死区面积百分比。后行统计学分析。不同时间，各组间两两进行比较，使用单因素方差分析比较差异大小。术后2、4、8周，实验1、2组的新生血管面积均明显高于对照组，且均有显著差异（p<0.05）。术后2、4周，实验1、2组间比较，新生血管面积也有显著差异（p<0.05），术后8周，实验1、2组间比较，新生血管面积无显著差异（p>0.05）。结果如下（见表1）。

表1不同时期新生血管占修复区平面的面积百分比（略）

注：同时间，组间比较用单因素方差分析，*表示与对照组比较p<0.05

2.4新生骨体积百分比统计分析

术后2、4、8周显微镜下，计算机图像采集并计算不同时期各例股骨头内，新生骨占坏死修复区的体积百分比。后行统计学分析。不同时间段，各组间两两进行比较，使用单因素方差分析比较差异大小。术后2、4、8周，实验1、2组的新生骨体积比均明显高于对照组，且均有显著差异（p<0.05），而术后2、4、8周，实验1、2组间比较，新生骨体积比无显著差异（p>0.05）。结果如下（见表2）。

表2不同时期新生骨占坏死修复区的体积百分比（略）

注：同时间，组间比较用单因素方差分析，*表示与对照组比较p<0.05

3讨论

本实验中所用骨髓单个核细胞是一种混合物质。是将所抽取的完整骨髓，通过1500r／min的转速离心20min后，取云雾状中层所得。与完整的骨髓相比较，我们去除骨髓中的血浆成份和红细胞，得到的是包括造血干细胞、骨髓基质干细胞、多能前体细胞、以及各类有核的血细胞等在内的混合物质。在本次实验研究中，我们观察到骨髓单个核细胞确有修复股骨头坏死的作用，通过查阅文献及相关分析，我们主要考虑两方面的生物学效应起作用。

骨髓单个核细胞的成骨作用，骨髓单个核细胞中含有一定数量的骨髓基质干细胞，虽然尚不能达到组织工程所需最低细胞数量，但dumas等［4］通过实验发现不同的离心方法以及复合载体等措施可以明显提高骨髓基质干细胞克隆形成能力，使骨髓基质干细胞成骨能力最大化。国内李亚非等［5］的研究成果也表明骨髓内基质干细胞在周围存在骨坏死、骨修复的条件，以及适宜的体内理化、营养环境诱导作用下可以分化、增殖，明显提高单位体积内基质干细胞、成骨细胞的数量和活性，增强成骨活性，促进新骨的生长，从而获得肯定的成骨效果。所以将骨髓单个核细胞应用到股骨头坏死的治疗，可以增加股骨头坏死修复过程中成骨的因素，促进股骨头坏死的修复。

骨髓单个核细胞的促进血管生成作用，骨髓单个核细胞中的造血干细胞和骨髓基质干细胞都是其能促进血管生成的关键。实验研究［6，7］证实，造血干细胞、骨髓基质干细胞在体内缺血的环境刺激下，都可以向血管内皮细胞方向分化，促进血管生成。该生物学效应，已经通过实验研究得到证实。并且在临床方面，也应用到了心肌梗死和糖尿病性下肢缺血［8］等疾病的治疗，且收到了良好效果。而在本次实验中，我们对坏死修复区，新生血管面积百分比的统计，也证明骨髓单个核细胞组成血管作用较其他两组强。同时股骨头坏死往往与股骨头内进行性血运障碍有关，所以考虑，骨髓单个核细胞能够促进血管生成，也是其修复股骨头坏死的作用机理之一。

股骨头坏死修复过程中，骨细胞坏死本身并不引起任何症状和可见的x线表现异常.只有当坏死后引起修复反应达到一定程度时，才可以引起x线片上骨密度的改变［9］。对于何时出现x线表现的变化，目前研究尚不统一，可能与是否脱位股骨头、是否切断圆韧带、是否切断股骨颈有关。本实验未脱位股骨头，未截断圆韧带和股骨颈，故修复开始较早。2周即可见修复局部云絮样密度增高影，同时实验各组修复因素多于对照组，故各时间段x片可见实验组修复效果好于对照组。而实验组间比较，并无明显差异，可见仅从x线看，骨髓单个核细胞和骨髓基质干细胞无明显差异。

依照上述分析，自术后2周开始，各实验组和对照组坏死股骨头已经开始修复，且有新生骨小梁形成，但各实验组在骨髓基质干细胞作用，以及骨髓基质干细胞和成血管因素共同作用下，成骨效果以及修复坏死股骨头效果明显好于对照组，在4周、8周时，效果差异也同样显著，该分析符合本次实验2、4、8周新生骨小梁统计分析结果。同时两个实验组间，各种成骨修复因素相互作用，可导致成骨差异不大，故统计学分析未见明显差异。

综上所述，骨髓单个核细胞作为骨髓离心提取物，去除了骨髓中对组织修复意义不大的成份，保留了关键成份。其复合异种骨是一种新的修复股骨头坏死的有效方法。

【参考文献】

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干细胞治疗范文

【关键词】帕金森病，干细胞治疗，文献综述

帕金森病又名震颤麻痹，是一种由于黑质多巴胺能神经元等进行性变性缺失所致的神经系统变性疾病，随着人口的老年化，其发病率呈逐年上升趋势。2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森组制定的诊断标准［1-2］：①运动减少。②至少符合以下1项：a：肌肉僵直；b：静止性震颤；c：姿势不稳。③至少符合以下4项中的3项：a：单侧起病；b：静止性震颤；c：逐渐进展；d：发病后多为持续性不对称性受累。尽管近10多年对帕金森病的发病机制认识及治疗手段探索均有长足的进步，但尚无法对其彻底根治。近年来对神经系统可塑性的研究及对神经再生和干细胞的认识逐渐加深，干细胞工程迅速发展。干细胞由于具有自我更新能力和多向分化潜能的特性，运用干细胞移植治疗帕金森病成为可能，极具发展前景和应用价值。

1神经干细胞的特点

1.1神经干细胞（NSCs）是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞，它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。Ourednik等认为神经干细胞是最适合于中枢神经系统细胞的替代治疗和基因治疗的细胞。

1.2神经干细胞可直接来源于胚胎成年哺乳动物的脑组织。在补充适量的促有丝分裂试剂如碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子或白血病抑制因子后，神经干细胞可在无血清的或含血清的培养液中生长。另一个提高增殖和延长培养时间的方法是，在神经元祖细胞中转染增殖调节基因。V-myc基因可转染神经干细胞，建立长久分化的神经干细胞系。最近研究表明，源于胚胎中枢神经系统各区域的NSCs具有不同的分化潜能，中脑来源的NSCs（mesencephalicneuralstemcells，mNSCs）更易于分化为DA神经元，是细胞移植治疗PD的理想细胞源。然而由于机体局部微环境的影响，仅少量mNSCs可在体内分化为DA神经元。

2影响神经干细胞分化的因素

首先，移植的神经干细胞的分化受其本身内在性质的影响。其次，神经干细胞所处的局部微环境因素和营养因素对神经干细胞的分裂和分化也具有一定的诱导作用。移植干细胞的分化与所处环境的神经类型和神经发育阶段有关。向体外培养的干细胞中加入不同组合的诱导因子如血清、组织提取液、各种细胞因子等，可使神经干细胞继续增值或向不同方向诱导分化。神经干细胞自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5％～5％，而在一定条件下，神经干细胞向多巴胺能神经元分化的比例甚至可达到80％。一些因子在多巴胺能神经元的分化中起作用。Nurrl和Ptx3等转录因子能够调节神经细胞向多巴胺能神经元分化。胶质细胞源性神经营养因子（glialcelllinederivedneurotrophicfactor，GDNF）是目前发现最强的DA神经营养因子，然而由于血脑屏障和脑组织结构的特点，使其应用受到了限制［3］。

3神经干细胞移植后的生物学特性

Alcksandrova等［4］将源于胚胎大鼠和人胚的神经干细胞分别移植于新生及成年大鼠脑内，于移植后1个月应用放射自显影技术观察，发现源于胚胎大鼠的神经干细胞在移植到成年大鼠脑后并未停止发育，它能够继续分裂、迁移，形成神经元和胶质细胞，免疫组化显示它能够表达特异性的神经递质和神经肽。将来源于8～12周胚胎的人神经干细胞，移植前培养两周，然后将其移植入大鼠脑内，于移植后10～20d，光镜下，所有的受体脑内均可见培养的人神经干细胞。成簇的移植细胞位于尾状核、侧脑室、白质、脑皮质，移植的细胞周围可见巨噬细胞，但未见明显的免疫反应。移植细胞的浓度从注射区向周围逐渐减少干细胞中可见有丝分裂细胞，表明在新的微环境下干细胞仍有增殖潜能。大鼠和人神经干细胞移植于成年大鼠脑后，表现相似的生物学行为并分化为神经元和胶质细胞。移植后，两者都可以连续地进行有丝分裂，从移植区迁移至受体脑的周围组织。大鼠脑内移植可作为人神经干细胞发育的生物模型。Brustle等将源于8周人胚的神经干细胞移植入大鼠胚胎脑室，也可见有神经元的分化，移植细胞可以在轴突、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等各个水平广泛整合。

成体中区神经系统中存在神经干细胞，也可以在体外培养扩增后移植到脑内。从成鼠前脑室下带中分离出神经干细胞，然后进行单细胞克隆、扩增、收集，分别移植至大鼠切割海马伞侧和正常侧的海马齿状回中，发现移植至海马齿状回中的神经干细胞能够存活，并可沿正常海马齿状回中固有的神经干细胞迁移路径即颗粒下层迁移。切割海马伞侧海马内存活和迁移的神经干细胞明显多于正常海马内的神经干细胞。提示切割海马伞侧海马齿状回内促进神经干细胞的存活并诱导其迁移、分化的物质增强。移植到小鼠嗅球的室管膜下区的神经干细胞可与该处的神经元发生广泛的整合。将神经干细胞移植入大鼠海马，观察到由神经干细胞分化来的神经元与宿主的神经元形成功能性的突触联系，体外实验也证实了这一点。所以，神经干细胞有望从解剖和功能上对受到损伤或变性的脑组织进行修复。移植的神经干细胞在大鼠脑内表现多巴胺的特性。Villa等［5］报道，应用V-myc转染的人胚神经干细胞，可以建立人神经干细胞系，使体外大量扩增神经干细胞成为可能。

对于帕金森病，产生人多巴胺能神经元是我们治疗的主要目的。胚胎和成年脑组织干细胞均可产生多巴胺能神经元，从而为帕金森病的移植治疗提供细胞来源。在增殖时，这些细胞形成表达中枢神经系统祖细胞标记（nestin）免疫活性的细胞球。在包含有IL-1b，IL-11，LIF和GDNF等分化介质中可形成TH免疫活性的细胞，这些细胞表现为多巴胺能神经元的形态学和功能的特性，包括多巴胺的产生和释放。目前已经培育出分化为酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞比例达98%的单克隆神经干细胞系。这些细胞可进一步扩增，可在液氮中储存，复苏后可以重新扩增。这些单克隆细胞系移植后可产生更高的多巴胺水平。源于人胚胎中脑的神经干细胞也可移植于被毁损的大鼠脑内，成功地恢复多巴胺水平。

利用神经干细胞作为基因治疗的载体是一种新兴的方法。在体外将外源基因导入神经干细胞，再经过培养、扩增，导入脑内，可以广泛用于中枢神经系统变性疾病及肿瘤的治疗。应用单个或多个外源基因对神经干细胞进行修饰，使其携带补充外源性多巴胺基因及营养因子基因，然后导入脑内，可用于帕金森病和阿尔茨海默病的治疗。植入的神经干细胞受局部微环境的影响，在植入部位分裂增殖为相应的神经细胞，补充和替代受损的细胞并与宿主的局部细胞整合，建立功能性突触联系；另一方面，外源基因在移植部位表达，发挥治疗作用。Park等将NT-3（神经营养素-3）转染神经干细胞，发现体外培养时分化为神经元的比例可达90%，移植到梗死灶后，有20%的细胞可向神经元方向分化，移植到缺血半暗带后，向神经元方向分化的比率可达80%。Ryu等［6］将TH联合GTPCH-1基因修饰的C17.2系NSC移植到PD鼠模型纹状体中，发现NSC能够很好的存活、迁移和分化，并能明显地改变动物行为。Kim等采用TH联合GTPCH-1基因修饰的永生化系mNSC（HB1.F3）移植治疗PD，能改善动物行为，并在移植区有大量的TH阳性细胞表达，表明NSC是基因治疗PD的有效理想载体。研究发现孤儿核受体（Nurr1）基因可促进NSC系如C17.2分化为DA神经元，减少其分化为胶质细胞的比例。Nurr1基因修饰后的胚胎干细胞分化为DA神经元的比例可从15%增至50%。这些神经元能表达中脑特异性的标志物，包括TH，Ret，Pitx3，Enl；而且将这些神经元移植到6-羟基多巴胺大鼠模型脑内可产生功能性整合，并出现行为学改善。因而Nurr1基因的移植可通过增加外源性DA神经元的数量对PD起治疗作用。O’KeeffeFE等［7］过度表达Pirx3于NSCs中，然后暴露于E11，这导致多巴胺能神经元细胞分化的明显增强，再植入6-羟基多巴胺毁损帕金森病大鼠脑内，导致明显运动功能恢复。另外，有大量Girkz阳性NSC起源的A9神经元在移植周围。这证明给予正确的信号，NSC能诱导成多巴胺能神经元。Li等通过腺病毒载体将Nurr1转染于NSC后，移植到6-羟基多巴胺大鼠模型脑内，发现其比单纯NSC移植治疗PD的病理学行为学改善更明显。胶质源性神经营养因子（GDNF）是目前发现针对DA神经元的一种最有效和特异性的神经营养因子。Liu等发现将表达NTN的C17.2-NSC植入PD模型鼠纹状体，移植细胞能够存活、分化，保护DA神经元，抵制6-羟基多巴胺对DA神经元的毒性并能改善动物旋转行为，其保护效果可持续4个月以上。褪黑素（MT）具有重要的免疫调节作用。Sharma等［8］应用MT联合C17.2-NSC移植治疗PD模型，发现对PD模型损害侧黑质纹状体的TH免疫反应有明显保护作用。目前，免疫调节蛋白或神经保护因子联合NSC用于细胞移植后免疫应答的调节也是PD细胞移植治疗的研究热点。

4前景与展望

神经干细胞移植治疗帕金森病目前已成为一种研究和治疗的方向，但对其分子机制、免疫排斥、移植诱导产生的运动等问题还需进一步研究。目前大部分结论都是基于动物实验的结果，能否在人类身上得到类似或更好的结果还尚未可知，在实用性、技术、神经生物学等方面存在一些问题。但随着分子生物学、基因工程技术的发展和对神经干细胞及帕金森病治疗研究的深入，特别是近来对移植诱导产生的运动的鉴定以及分化至多巴胺能神经元的新方法的出现［9］，有望对神经干细胞移植治疗帕金森病的研究产生更好的推动作用。

参考文献

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干细胞治疗范文篇3

[关键词]1型糖尿病；胚胎干细胞；成体干细胞；β细胞

[中图分类号]R587.1[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2008）10（b）-012-03

据估计，2000年全球糖尿病患者已超过1.5亿，到2025年，这一数字将增加一倍，其中5%~10%为1型糖尿病[1]。1型糖尿病是T细胞介导的自身免疫性疾病，一旦发病需要终身依赖胰岛素，但是这种替代治疗缺乏食物的反馈调节，不符合生理要求，易发生胰岛素耐受，并且还会发生高血糖相关的并发症。通过胰岛移植能够达到不依赖胰岛素的效果，但是排斥反应和供体来源不足限制了其临床应用。因此，如何让糖尿病达到完全治愈，受到了世界医学界的广泛关注。而干细胞治疗作为一种治疗疾病的新方法，能够从细胞和基因水平治疗糖尿病，达到临床上的治愈，越来越引起学者的重视。尤其是近年来随着对成体干细胞的认识和基因治疗的不断发展，将干细胞用于1型糖尿病的治疗成为一个研究热点。

1胚胎干细胞

胚胎干细胞是指来源于囊胚的内细胞团和受精卵发育至桑椹胚之前的胚胎细胞，具有自我复制和多向分化潜能。早在1970年，MartinEvans就已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养，而人胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。已有许多研究结果证明，胚胎干细胞可以被诱导分化为胰岛素分泌细胞。Soria[2]最先采用基因工程的方法将小鼠胚胎干细胞诱导分化为对葡萄糖敏感的胰岛素分泌细胞。Assdy等[3]则将人胚胎干细胞在体外贴壁和悬浮培养，研究发现，这些细胞对胰岛素染色阳性，并表达胰岛β细胞表面标记如葡萄糖载体蛋白(GLUT2),葡萄糖激酶因子(Pdx-1/Ipf-1)和神经元-3转录因子。然而，Sipione等[4]在检测胚胎干细胞分化的表达胰岛素细胞的特性时发现这些细胞缺乏典型的β细胞颗粒，不能显示对C肽的免疫反应性，且这些细胞大部分都已凋亡，把它们移植到糖尿病鼠中，并不能逆转高血糖状态，因此得出胚胎干细胞分化的表达胰岛素的细胞不是真的β细胞。Miyazaki[5]则利用质粒载体将对β细胞发育起关键作用的中枢胰腺转录因子Pdx-1转染胚胎干细胞，将这些转录因子阳性的细胞移植到糖尿病鼠中，可使血糖水平恢复正常。然而，质粒转染胚胎干细胞的基因整合效率很低，还存在病毒感染的风险，因此，对胚胎干细胞进行基因修饰不是一个很好的选择。为此，Kwon等[6]利用蛋白转导技术把转录因子Pdx-1直接通过细胞膜转运到胚胎干细胞的细胞核，这种经过转导的Pdx-1可激活其下游的靶基因，引起胚胎干细胞优先分化成表达高水平胰岛素的细胞，而且这些细胞对C肽染色阳性。还有人把胚胎干细胞和鼠的胎胰组织共培养，可诱导胚胎干细胞表达胰岛素和Pdx-1,这些细胞也可分泌C肽，将它们移植给糖尿病鼠，能使血糖水平恢复正常[7]。

2成体干细胞

成体干细胞是存在于胎儿和成体不同组织内的多潜能干细胞，具有自我复制能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用。传统观点认为，成体干细胞一般只能分化成特定的细胞或组织，但是越来越多的研究表明，成体干细胞具有可塑性，即可生成另一组织的特化细胞，保持向多种组织分化的能力。目前，研究用于治疗1型糖尿病的成体干细胞主要有胰腺干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等。

2.1胰腺干细胞

胰腺干细胞是胚胎发育中没有进行终末分化的胰腺细胞，能分化为胰腺各种细胞。早在1997年，Cornelius等[8]从尚未发病糖尿病鼠的胰腺中分离出了能产生胰岛的多能干细胞，该细胞可长期培养并分化为表达胰岛素、胰高糖素和生长抑素的胰岛样细胞团。Zulewski等[9]研究发现，在人和大鼠胰岛中均存在nestin染色阳性的细胞，这些细胞在体外培养时能分化为胰腺外分泌细胞、导管细胞、胰腺内分泌细胞及肝细胞等。Ramiya等[10]则报道从分离的胰腺导管培养中获得了胰腺干细胞，在体外培养了3年，该细胞可分化为胰岛样细胞团，将这些细胞团移植到非肥胖糖尿病（NOD）鼠，可显著降低其血糖。Bonner-Weir等[11]从人胰腺组织诱导分化出胰岛样细胞团，在这些细胞团中检测到细胞发育因子19(CK-19)阳性导管细胞和胰岛素阳性的胰岛细胞，用免疫组化的方法证实了这些细胞含有胰岛细胞和其他同源细胞群，并且有血糖刺激胰岛素分泌和自我增殖分化为胰岛样组织的能力。

2.2间充质干细胞

传统认为间充质干细胞的主要功能是对造血系统细胞起支持和连接作用，参与构成造血干细胞的生存和分化环境，但之后的研究发现，间充质干细胞具有多向分化潜能。Chen等[12]从Wistar大鼠的骨髓中分离出间充质干细胞，用尼克酰胺和β-巯基乙醇诱导分化，这些诱导后的细胞能够表达胰岛相关基因的mRNA，在体外呈现出葡萄糖依赖的胰岛素分泌。将这些细胞移植到链脲佐菌素（STZ）处理的大鼠体内，能够控制其血糖水平。Moriscot等[13]从人骨髓中提取间充质干细胞，以腺病毒作载体，将3个特异性的β细胞转录因子(Foxa2，Hb9，Pdx1)进行基因转染，与人的胰岛组织做共培养，结果显示，该细胞可以表达几乎所有的胰岛β细胞的相关基因。Lee等[14]则直接用来源于人的骨髓间充质干细胞作心内注射，按照糖尿病的不同时间段注入糖尿病小鼠体内，结果不但可以减少胰岛细胞的损伤，而且也可以保护肾脏肾小球细胞。Kim等[15]把人的间充质干细胞转入腺病毒耦联的前胰岛素基因，分化后的细胞分泌胰岛素和C肽，但是表达的胰岛素和C肽之间没有相关性，笔者认为可能是酶不稳定的原因。最近，Chao等[16]将人脐血来源的间充质干细胞进行体外诱导分化，得到胰岛样细胞团，在这些细胞群中可以检测到胰岛素和其他胰岛β细胞相关基因的表达，将其移植到STZ处理的大鼠体内，高血糖显著改善。

2.3造血干细胞

在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在20世纪50年代，临床上就开始应用骨髓移植(BMT)方法来治疗血液系统疾病。而近年研究发现，造血干细胞除可以分化为各系血细胞外，还可以分化为多种非造血组织的细胞，如肌细胞、肝细胞、神经细胞等。Ianus等[17]将标记有绿色荧光蛋白的骨髓干细胞移植给小鼠体内，6周以后在受体小鼠的胰岛内发现了骨髓来源的胰腺细胞，这些细胞表达胰腺β细胞所特有的遗传标志物，当给予生理性葡萄糖刺激时，骨髓来源的细胞分泌胰岛素，并重现了胰腺β细胞钙离子的细胞内流。为了进一步证实，Hess等[18]将标记有绿色荧光蛋白的骨髓细胞移植给经过致死剂量照射的STZ处理小鼠，17d后小鼠的血糖正常，有正常的胰岛素分泌，并表现出随着血糖升高胰岛素分泌增强的现象。此外，研究显示，c-kit(干细胞表面标志物)表达阳性的骨髓细胞可使高血糖水平降低，而c-kit阴性的细胞却无此功能。笔者认为骨髓干细胞进入胰岛后分化为内皮细胞，并刺激胰腺前体细胞增殖，使这些前体细胞最终分化为胰腺内分泌细胞。另外，也有人研究通过诱导对自身抗原的免疫耐受来预防和治疗1型糖尿病。早在1997年，French等[19]就构建了由MHC-Ⅱ类分子启动子操控的胰岛素原的转基因NOD鼠(NOD-PI鼠)，并观察到其胰岛炎几乎不存在，糖尿病的发病被成功预防。Steptoe等[20]则进一步将这种转基因NOD鼠的造血干细胞移植给普通的NOD鼠，发现可以防止普通NOD鼠自发性糖尿病的形成。在此基础上，Chan等[21]把正常NOD鼠的造血干细胞进行体外基因转染，使其表达胰岛素原，移植给NOD鼠，胰岛炎的发生和严重程度均明显减少。

综上所述，虽然干细胞是目前公认的治疗糖尿病比较好的方法，但目前仍处于实验阶段，将其应用于临床还存在许多困难。首先，胚胎干细胞的来源有限，体细胞克隆的人类胚胎操作过程繁琐，成本太高，且伦理学上未得到人们的普遍认同。其次，虽然胰腺干细胞来源无限，不存在伦理学问题，可以自体移植，但是它没有明确的表面标志，不易采集纯化，移植后瘤样变的问题还不能解决。第三，间充质干细胞的来源也比较丰富，自体移植的免疫排斥也较小，但对于它的跨胚层分化仍有争议，而且分化后的细胞在体内的功能维持时间还没有报道。第四，造血干细胞不仅来源丰富，易采集，而且能抑制自身免疫排斥反应，尤其是它在基因治疗方面的优势使其拥有广泛的应用前景，必将继续成为1型糖尿病治疗的研究热点。

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