单细胞生物的特点篇1

一、教学目的要求

(一)要求学生比较系统地掌握关于细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等方面的基础知识，以及这些知识在农业、医药、工业、国防上的应用。

(二)通过生物学基础知识的学习，使学生受到辩证唯物主义和爱国主义思想的教育。

(三)要求学生掌握使用高倍显微镜，做简单的生理实验等的基本技能。

(四)培养学生自学生物学知识的能力，观察动植物的生活习性、形态结构、生殖发育的能力，分析和解释一些生物现象的初步能力。

二、确定教学内容的原则

(一)从学生今后进一步学习和参加社会主义现代化建设的需要出发，认真选取生物学基础知识：选取生物的结构和生理的知识。结构知识是理解生理知识的基础。生理知识是阐明生物的新陈代谢，生长、发育和生殖等的基础知识。因此，必须重视选取形态结构和生理的知识。

(二)选取生物学基础知识，必须做到理论密切联系实际。

1.选取生物学基础知识，要密切联系工农业生产实际。生物学是农业、畜牧业和医学等方面实践的理论基础，通过学习生物学知识，要使学生知道生物与生产的关系十分密切，应该利用和改造有益的生物，防除有害的生物。

2.要密切联系各地的自然实际。由于我国幅员广大，各地的生物种类有很大差别。因此，所选取的植物和动物，既要重视其典型性，又必须尽可能是各地比较常见的，以便学生可以直接观察到这些动植物和了解这些动植物的生活规律。

3.选取的生物学基础知识，要密切联系学生的日常生活实际，使学生加深对生物学知识的理解，同时更加深刻地认识学习生物学的意义。

(三)适当选取反映现代生物科学水平的生物学基础知识。

现代生物科学发展很快，生物课必须重视用现代生物科学的观点来阐述教学内容，并且适当地增加反映现代生物科学水平的知识内容，使学生对生物科学发展的现状有个初步的认识，为他们进一步学习现代生物科学知识和参加工农业生产打下必要的基础。

三、班级现状分析

本学期我任教高二（2）、（3）、（4）三个班级，三个班级人数分别为：46、45、46人，虽然通过班主任，我对个班的现状有了一点了解，但由于生物是从高二开始的起始课程，所以具体情况还不能下定论。

四、教学进度安排

高中阶段学习的生物学知识，是在初中生物教学内容的基础上进行的，学习生物的基本特征，侧重于生命活动的共同规律的内容。主要包括细胞、新陈代谢及其调节、生殖和发育、遗传和变异的知识。初中和高中两个阶段所学的生物学基础知识，既有所分工、又互相衔接，高中生物学是初中生物学知识的综合、概括和提高。

高中二年级开设的生物必修课（第一学期），每周2课时，共计34课时。讲述细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等生物学基础知识。

五、教学内容及其课时安排

高中生物必修课教学进度

单元

知识

学生实验

课时

要点

教学要求

项目

绪论

生物的基本特征

生物科学的新进展

高中生物课学习的要求和方法

B

A

A

2

生命的物质基础

组成生物体的化学元素

组成生物体的化合物

B

C

实验：显微镜的结构和使用；生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定。

2+1+1

生命的基本单位-细胞

细胞主要的亚显微结构和功能

细胞周期

细胞分裂

B

C

A

实验：

1．颤藻和水绵细胞的比较观察

2．植物细胞的有丝分裂。

2+1+2+1

生物的新陈代谢

光合作用的发现，光合作用及其重要意义

根对水分的吸收和利用

植物的矿质营养

动物的营养

呼吸作用

A

B

B

B

B

实验：

1．叶绿体色素的提取和分离

2．植物细胞的质壁分离与复原。

2+5

应激性和生命活动的调节

植物生命活动的调节

高等动物的激素调节

高等动物的神经调节

A

A

B

1+1+2

生殖和发育

减数分裂和配子的形成

A

2

具体教学内容如下：

绪论

生物的基本特征(细胞结构，新陈代谢，生长现象，应激性，生殖和发育，遗传和变异，生物与环境的相互影响)的概述。

生物学的研究对象和发展方向。学习生物学的重要意义。

说明：生物学的研究对象和发展方向，只要求学生作一般了解。

一、细胞

细胞的发现。细胞学说。原生质的概念。

细胞的化学成分：水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。

细胞的结构和功能：原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体、内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。一个细胞是一个有机的统一整体。细胞的分裂：无丝分裂。有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。

〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，初步学会使用高倍显微镜。

说明：在《细胞》中，以下内容只要求学生作一般了解。

1.细胞的发现，细胞学说，原生质的概念。

2.内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。

3.无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式有有丝分裂。

二、生物的新陈代谢

新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。

绿色植物的新陈代谢：水分代谢——细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水；细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。渗透吸水的原理。渗透作用的概念。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。

矿质代谢——植物需要的元素(大量元素和微量元素)。根吸收矿质元素的过程——交换吸附。植物对离子的选择吸收。矿质元素的利用。

光合作用——光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应，暗反应)。ATP(三磷酸腺苷)的简式，ATP与ADP(二磷酸腺苷)的相互转变。

呼吸作用——呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。

动物的新陈代谢：体内细胞的物质交换——单细胞动物与外界环境直接进行物质交换；多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。

物质代谢——食物的消化(单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。哺乳动物的消化过程概述)。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。

能量代谢——气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。

新陈代谢的基本类型：同化作用的两种不同类型(自养型、异养型的概念和特点)。异化作用的两种不同类型(需氧型、厌氧型的概念和特点)。

〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。

(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。

(3)叶绿体中色素的提取和分离。

说明：1.在《生物的新陈代谢》中，以下内容只要求学生作一般了解。

(1)细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。*渗透作用的概念。

(2)根吸收矿质元素的过程——交换吸附。

*(3)植物对离子的选择吸收。

(4)呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。

(5)单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。

(6)单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。

三、生命活动的调节(4∶0)

植物生命活动的调节：生长素的发现。植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。

动物生命活动的调节：高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。昆虫的激素调节(内激素、外激素的分泌部位和生理作用，昆虫激素在生产上的应用)。神经调节(神经系统的调节功能)。≤第一范文网整理该文章，版权归原作者、原出处所有≥

说明：在《生命活动的调节》中，以下内容只要求学生作一般了解。

*1.生长素的发现。

*2.昆虫的激素调节。

四、生物的生殖和发育(9∶0)

生物的生殖。生殖的概念。

生殖的种类：无性生殖(分裂生殖，孢子生殖，出芽生殖，营养生殖)；有性生殖(配子生殖中的卵式生殖)。这些生殖方式的特点和概念。

减数分裂与有性生殖细胞的成熟：减数分裂的概念和意义。精子的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。

生物的发育。发育的概念。

植物的个体发育(以荠菜为例)：胚的发育过程，胚乳的发育过程。

动物的个体发育(以蛙为例)：胚的发育过程(包括卵裂、囊胚、原肠胚各期)，各种组织、器官和系统的形成。胚后发育。胚的发育与环境的关系。

说明：在《生物的生殖和发育》中，以下内容只要求学生作一般了解。

*1.生殖的种类。

*2.无性生殖和有性生殖方式的特点和概念。

*3.植物的个体发育(以荠菜为例)。

1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

（一）生命的基础

细胞的化学成分——水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。

原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。

有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。

2.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：

内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。

无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。

3.〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，学会使用高倍显微镜。

(二)生物的新陈代谢(5∶2)

1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。

细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。植物需要的元素(大量元素和微量元素)。矿质元素的利用。

光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应、暗反应)。ATP(三磷酸腺苷)的简式，ATP与ADP(二磷酸腺苷)的相互转变。

呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。

多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。

哺乳动物的消化过程概述。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。

气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。

3.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：

细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。

根吸收矿质元素的过程——交换吸附。

呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。

单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。

4.〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。

(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。

(3)叶绿体中色素的提取和分离。

(三)生命活动的调节(2∶0)

在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。

高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。神经调节(神经系统的调节功能)。

(四)生物的生殖和发育(3∶0)

共2页,当前第1页1

在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

生物的生殖。生殖的概念。

减数分裂的概念和意义。精子的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。

生物的发育。发育的概念。

五、提高教学质量的具体措施

1、认真抓好生物学基础知识的教学。

高中生物学的知识，内容比较系统、全面。在课前要认真分析教材，掌握教材的重点、难点，研究学生的生理、心理的特点和学习规律，通过课堂教学、实验、课外作业等各个教学环节，努力培养学生的学习兴趣，启发学习的自觉性，在充分调动学生积极性的情况下，引导他们认真学好生物学基础知识，做到正确理解，巩固记忆，举一反三，为他们今后进一步学习有关专业知识和参加工作打下较好的知识基础。

2、重视对学生进行思想教育。

高中生物学的教学内容，十分重视对学生进行进化观点和生态学观点的教育。教师在教学过程中，应该结合高中生物学知识的讲述，对学生进行这两个观点的教育，要使学生理解现今世界上形形色色的动植物都是逐渐进化来的，一切生物和它们的生活环境都是分不开的，生物必须依赖于它们的环境而生活，而生物的生命活动反过来又时时刻刻在改变着环境，从而对学生进行辩证唯物主义教育。再有，通过讲述祖国丰富的动植物资源，我国古代的和现代的生物科学的成就，对学生进行爱国主义思想教育。

3、重视对学生进行生物学基本技能的训练和能力的培养。

生物学是一门实验科学，实验、观察、标本的采集和制作等在生物教学中有十分重要的地位。这些教学手段对于培养学生学习生物学的兴趣，更好地理解生物学基础知识，掌握实验基本技能，发展他们的智力和培养能力，都有重要的作用。教师一定要积极创造条件，尽可能让学生亲自动手、多实践。教师对教学大纲和教材中规定的学生课外作业也要妥善安排，并指导学生认真完成。通过教学的各个环节和课外活动，努力培养学生的自学生物学知识的能力、观察能力、科学地分析和解释一些生物现象的能力。

4、加强直观教学

直观教学是帮助学生更好地理解教学内容、调动学生学习积极性、巩固记忆的重要方法之一。在实际教学中，我要积极地自制直观教具，密切结合教学内容使用教学挂图、标本、模型、幻灯和教学电影等进行教学。

5、坚持理论密切联系实际

要重视密切联系本地区动植物种类的实际进行教学。教师在教学过程中，应该密切结合本地区的实际情况，选择或者补充讲述当地常见的和对经济发展有重要意义的动植物种类。

6、积极组织和指导生物学课外科技活动。

单细胞生物的特点篇2

一本章的主要内容和特点

本章是在学生初中阶段初步学习过细胞的知识，以及在前一章学习了关于生命的物质基础知识的基础上，进一步学习高中阶段的关于细胞的知识。生物体的一切生命活动，主要是在细胞内进行的。因此，高中阶段有必要从细胞是生命活动的基本单位的高度，进一步讲述真核细胞的亚显微结构和主要功能的知识，以及有关细胞增殖、分化、癌变和衰老的知识。

本章包括三节教材：第一节《细胞的结构和功能》；第二节《细胞增殖》；第三节《细胞的分化、癌变和衰老》。第一节《细胞的结构和功能》内容很丰富，共分三小节：第一小节《细胞膜的结构和功能》，本小节内容以及章的引言和第一节的引言，共需用3课时教学；第二小节《细胞质的结构和功能》，需用2课时教学；第三小节《细胞核的结构和功能》，共需用2课时教学。第二节《细胞增殖》，需用1课时教学。第三节《细胞的分化、癌变和衰老》，需用1课时教学。此外，本章有两个学生实验。

第一节《细胞的结构和功能》，在分成小节讲述之前，用了几小段文字和一些图表，先介绍了几点有关的内容：观察细胞内部的精细结构，必须应用电子显微镜或其他更为精密的仪器；细胞的种类繁多，大小、形状各不相同，功能也不相同；细胞可分为原核细胞和真核细胞两大类，绝大多数生物是由真核细胞构成的；细胞虽然微小，但是有非常精细的结构和复杂的自控能力，这些是细胞能够进行各种生命活动的基础。真核细胞比原核细胞复杂得多，因此，首先学习关于真核细胞的结构和功能的知识。

第一节的第一小节《细胞膜的结构和功能》，主要讲述细胞膜的分子结构和细胞膜的主要功能两方面的内容。第一方面，关于细胞膜的分子结构，明确提出细胞膜是一层由磷脂和蛋白质构成的膜。在细胞膜的中间是磷脂双分子层，这是细胞膜的基本支架；有的蛋白质分子排布在磷脂双分子层的表层；有的蛋白质分子部分嵌插或贯穿在整个磷脂双分子层中。构成细胞膜的磷脂分子和蛋白质分子大都是可以流动的，这种特点对于细胞膜完成各种生理功能非常重要。再有，在细胞膜的外表有一层糖蛋白，叫做糖被，它在细胞生命活动中有重要功能。第二方面，关于细胞膜的主要功能，主要讲述细胞膜与周围环境进行物质交换的功能，而对细胞膜的其他多种功能不可能都加以介绍。由于细胞膜与周围环境进行物质交换的内容比较复杂，学生在学习上有一定难度，因此教材本着化繁为简、深入浅出的精神，主要讲述了自由扩散方式和主动运输方式，略去了其他运输方式。教材强调指出，自由扩散是被动运输的方式；主动运输方式的特点是必须有载体蛋白质的协助，需要消耗细胞内新陈代谢所释放的能量。主动运输能够保证活细胞按照生命活动的需要，主动地选择吸收所需要的营养物质。接着，在讲了上述两种运输方式的基础上，明确指出细胞膜的通透性特点：细胞膜是一种选择透过性膜。

第一节的第二小节《细胞质的结构和功能》，主要讲述细胞质基质和细胞器两方面的内容。第一方面，关于细胞质基质的内容有：细胞质基质中含有多种无机的和有机的化合物；细胞质基质是活细胞进行新陈代谢的主要场所；在细胞质基质中存在着多种细胞器。第二方面，关于细胞器的内容，占了本节的大部分篇幅，重点讲了线粒体和叶绿体这两种细胞器，主要说明这两种细胞器在动植物体中存在的部位、在细胞内的分布、基本结构和主要功能，这些知识是学习后面有关章节必备的基础知识。此外，还简要讲述了内质网、核糖体、高尔基体、中心体和液泡这5种细胞器。本节教材最后强调指出，在活细胞完成各种生命活动的过程中，细胞质基质和细胞器是相互协调的，各种细胞器之间也是密切联系的。，全国公务员共同天地

第一节的第三小节《细胞核的结构和功能》，主要讲述细胞核的结构、细胞核的主要功能、原核细胞的基本结构三点内容。第一点，关于细胞核的结构，简要介绍了核膜、核仁和染色质的知识。第二点，关于细胞核的主要功能，强调了细胞核是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动的控制中心，因此它是细胞结构中最主要的部分。第三点，关于原核细胞的基本结构，很简要地介绍了原核细胞在大小、细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核这几个方面与真核细胞不同的特点，并且强调指出原核细胞最主要的特点是没有由核膜包围的细胞核。

第二节《细胞增殖》，在节的引言中指出细胞增殖是生物体的重要基本特征，细胞以分裂的方式进行增殖；细胞分裂是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础；真核细胞的分裂方式有有丝分裂、无丝分裂和减数分裂三种方式。本节教材主要讲述两方面内容：一方面，以大部分的篇幅讲述真核细胞的有丝分裂方式；另一方面，简要介绍真核细胞无丝分裂方式的特点。

关于有丝分裂的内容，主要有三点。在讲述这三点内容之前，先明确指出有丝分裂方式是真核细胞进行细胞分裂的主要方式，多细胞生物体以有丝分裂的方式增加体细胞的数量，体细胞进行有丝分裂是有周期性的。接着，讲述第一点内容，即细胞周期，主要讲述了细胞周期的概念、细胞周期包括分裂间期和分裂期两个阶段、这两个阶段所占时间的长短。第二点内容，讲述细胞分裂间期，强调指出这个时期是新细胞周期的开始，最大的特点是完成了DNA分子的复制和有关蛋白质的合成，为紧接着的细胞分裂期准备了条件，因此，细胞分裂间期是细胞周期中极为关键的准备阶段。第三点内容，讲述细胞分裂期，明确指出这个时期的特点主要是细胞核明显地发生着染色体的有规律的连续变化。为了研究的方便，分裂期又分为前期、中期、后期、末期。本节教材以较多的篇幅，着重讲述了分裂期各个时期细胞核内染色体的变化特点。在讲述了有丝分裂上述知识的基础上，最后指出有丝分裂的重要意义：将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去；由于染色体上有遗传物质，因此使生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。

关于无丝分裂方式，简要介绍了这种分裂方式的过程，以及因为在分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体，所以叫做无丝分裂。

关于减数分裂方式，仅仅指出这种分裂方式是一种特殊方式的有丝分裂，与有性生殖细胞的形成有关，具体的分裂过程留待后面的有关章节讲述。

第三节《细胞的分化、癌变和衰老》，主要讲述了三方面的内容。关于细胞的分化，主要内容有：首先，明确指出细胞分化是生物界中普遍存在的一种生命现象，仅有细胞的增殖，而没有细胞的分化，生物体是不能正常发育的。接着，讲述了细胞分化的概念，并且说明细胞分化是在生物体整个生命进程中的一种持久性变化，但是在胚胎时期达到最大的限度。再有，提出多细胞生物必须经过细胞分化，体内才会形成多种不同的细胞和组织。最后，说明高度分化的植物细胞仍然保持着细胞的全能性。

关于细胞的癌变，之所以放在本节教材的第二部分来讲，是因为细胞的畸形分化与癌细胞的产生有直接关系，与细胞分化的知识有密切联系。细胞癌变的主要内容有：首先，提出癌细胞有一些独具的特征，教材中只介绍了癌细胞能够无限增殖、形态结构发生了变化、表面也发生了变化等特征。其次，讲述了导致细胞癌变的三大类致癌因子，即物理致癌因子、化学致癌因子和病毒致癌因子，同时也提出了致癌基因。最后，简要讲述了从多方面来预防细胞发生癌变。

关于细胞的衰老，首先说明细胞的衰老和死亡也是一种常见的生命现象。接着，进一步说明衰老的过程是细胞内生理和生化发生变化的过程，最终反映在细胞的形态、结构和功能上发生了变化，因而具有细胞衰老的共同特征，教材中提出了5种衰老的特征。最后指出，至今还没有一种假说能够完全揭示细胞衰老的原因。目前的科研工作表明，细胞衰老可能是多种内因和外因共同作用的结果。

二本章与其他章的联系

1.关于细胞膜的分子结构特点和功能的知识，对于后面学习《生物的新陈代谢》，讲述物质出入细胞、物质代谢等内容，是重要的基础知识。

2.关于细胞器的知识，与讲述物质代谢和能量代谢有直接关系。例如，叶绿体的结构和功能与光合作用关系密切，线粒体的结构和功能与有氧呼吸关系密切。

3.关于有丝分裂的知识，对于后面学习《生物的生殖和发育》一章中关于减数分裂的知识，是重要的基础。

单细胞生物的特点篇3

【关键词】植物细胞培养技术研究发展

一、植物细胞培养发展简介

十九世纪九十年代，Haberlandt首先进行了植物细胞的培养；1939年，White，Nobecourt，Gautheret分别，提出非分化的植物细胞可以无限期地进行培养，为植物细胞培养的发展奠定了基础。1942年，Gautheret发现植物细胞培养可产生次级代谢产物；1954年，Muir等第一次进行了植物细胞悬浮培养；自从1956年，Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来，据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。

二、植物细胞培养技术

植物细胞的培养方法较复杂，根据培养对象可分为原生质体培养和单细胞培养；根据培养基的类型可分为固体培养和液体培养两大类；根据培养方式分为悬浮培养、平板培养、看护培养及固定化细胞培养等；根据培养规模大小可分为小规模培养和大批量培养。

（一）植物细胞培养的基本技术。

1.固体培养

固体培养是加入一定量凝固剂的液体培养基作为培养基的培养方式，其优点是简便，对实验设备要求简单，缺点是外植体或愈伤组织只有一部分表面能接触培养基，容易产生浓度差，影响其生长速度；同时固体培养基不利于气体交换和物质排泄，造成毒害；另外还有光线分布不均匀等缺点。

2.液体培养

液体培养是以配置的营养液作为培养基的培养方式，液体培养静止液体培养和震荡液体培养。液体培养弥补了固体培养的不足，但要求技术较高，成本较贵。

（二）单细胞培养技术。

1.看护培养技术

用一块愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法称为看护培养。这种从单细胞起源的愈伤组织连同它衍生的培养物一起叫做一个单细胞无性系。此系统提供了一个单细胞系，它的生长因子是由愈伤组织和培养基提供的。

2.平板培养技术

平板培养是将一定密度的悬浮培养细胞接种到一薄层的固体培养基上进行培养的技术。由于平板培养具有筛选效率高、筛选量大、操作简单等优点，被广泛用于遗传变异、细胞分裂分化和细胞次生代谢物合成的种细胞筛选等各种需要获得单细胞克隆的研究。

3.微室培养技术

微室培养是将细胞培养在微量容器的少量培养基中，如凹穴载玻片上或多室培养盘内。优点是在培养过程中可连续进行显微观察以及多因子大量组合实验。但由于培养量少，水分难以保持，培养基的养分及P等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。

（三）植物细胞的大规模培养。

1.固定化培养技术

植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。是由Brodelius等人于1979年首次生产植物次生代谢物应用成功的。与悬浮培养相比，它具有提高反应效率、延续反应时间及保持产物生产的稳定性等特点。

2.两相培养技术

在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相，细胞或组织在水中生长和合成次生代谢物质，次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中，然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术，称为两相培养技术。其优点是由于产物的不断释放与回收，有可能真正实现植物细胞的连续培养，从而降低生产成本。

3.反义技术

根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补DNA或RN段，抑制或封闭某些基因表达的技术，通过此技术，可以将反义DNA或RN段导入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强，从而提高目的物的含量，同时抑制其他化合物合成。

4.冠瘿培养技术

利用根癌农杆菌感染植物可以将Ti质粒的T-DN段（含有诱导冠瘿组织发生的tms基因和tmr基因）整合进入植物细胞的基因组，诱导细胞冠瘿组织的发生。冠瘿组织离体培养具有激素自主性、增殖速率较快等特点，另外，次生代谢产物合成稳定性和能力较强，用来生产有用的次生代谢产物有良好的开发前景。

5.毛状根培养技术

毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）感染后产生的病态组织。感染过程中，发根农杆菌Ti质粒T-DNA转移并整合到植物基因组中。具有激素自养，增殖速度快，次级代谢产物含量高且稳定等特点。

6.添加诱导子或引导物技术

诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质，当它在与植物的相互作用时，能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，积累特定地目的次生代谢物，从而提高植物次生代谢产物的产量。

7.两步培养技术

植物细胞生物量增长与代谢产物积累之间是不同步的，用同一种培养基同时达到细胞的最佳生长和最佳次级代谢产物的积累是不现实的，因此采用两步培养技术，即在不同阶段使用不同的培养基。在细胞的生长阶段使用生长培养基，促进生物量的增长，生产培养阶段使用生产培养基，促进产物的生成，从而达到提高产物产率的目的。

8.植物细胞悬浮培养生物反应器技术

植物细胞悬浮培养生物反应器技术是发酵技术在植物细胞大规模培养的应用。植物细胞培养对反应器的要求简单、坚固、价廉、多用途、操作稳定、维修更换附件方便之外，要求反应器在满足供氧的前提下，能为细胞的生长、次生代谢产物的合成提供一最佳的外部条件，即均一的反应体系、温和的流场、合适的细胞团太小以及分布。生物反应器技术具有很多优点：工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。

9.三维细胞培养技术

三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞一载体复合物。目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中，涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少，但这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。

三、植物细胞培养存在的问题

（一）适用范围较窄。

许多的植物类型或基因型还不能按照人们的目的用现有的技术培养成功。甚至一些重要农作物的基本技术如棉花花药培养研究，至今尚未取得突破。

（二）所建的技术体系稳定性差。

同一技术在不同实验室、不同的人操作，甚至不同的批次之间都有差异，难以推广应用。

（三）随机性太强。

由于组织细胞培养过程中一些作用机制还不太清楚，当无性繁殖扩增保存材料时，对无性系变异现象无法控制，长期培养的材料往往会失去分化能力。而进行无性变异筛选时希望的变异个体又因变异率低而选不出。

参考文献：

[1]王海波，程奇.植物细胞工程的回顾与展望[J]，科技导报，1993，3.

[2]刘书志.植物细胞培养和植物细胞培养装置[J]，工业技术，2011，31.

[3]李晓惠，陈蕾.植物细胞培养技术的发展与应用[J]，安徽农学通报，2006，12.

单细胞生物的特点篇4

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物

健康成年新西兰大白兔30只(由北京大学医学部实验中心提供)，雌雄不限，体质量1．0～1．5kg。

1．1．2主要试剂和仪器

ABCG2单克隆抗体(美国MILLIPORE公司)，细胞角蛋白(cytokeratin，CK)3单克隆抗体(美国MILLIPORE公司)，ANTI-BCRP1FITC(美国MILLIPORE公司)，黏蛋白5AC(MUC5AC)单克隆抗体(美国Abcam公司)，MTT(美国SCICRESTBIOTECH公司)。倒置相差显微镜(OLIMPUS，日本)，CO2培养箱(MCO-18AIC，SANYO公司，日本)，流式细胞仪(BD公司，美国)，酶标仪(SLT．SPETRAN公司，德国)，共聚焦显微镜(Zeiss公司，美国)，荧光显微镜(OLIMPUS公司，日本)。

1．2实验方法

1．2．1LSC的原代培养

采用组织块培养法。将兔子以过量乌拉坦静脉注射处死后，用碘伏棉球消毒眼睑周围3次，迅速取出眼球，在显微镜下去除眼球周围肌肉组织，生理盐水冲洗3次。在无菌条件下将处理后的眼球用含硫酸妥布霉素的生理盐水(硫酸妥布霉素注射液生理盐水=120配制)浸泡2次，每次15min;剪下角膜片，去除结膜、虹膜等组织，在体视显微镜下剪去角膜中央部分。无菌条件下将兔角膜缘组织剪成约1mm×2mm的组织块，将3～5枚组织块蘸取少量培养基后上皮细胞面向下置于培养皿中，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，2h后待其贴附良好时加入适量含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，继续置于恒温CO2培养箱中培养。每2d更换1次培养基，每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。

1．2．2LSC的传代培养

当细胞生长达到培养板的80%～90%时，PBS冲洗2次后，加入适量胰蛋白酶与细胞充分接触2～3min，待细胞变圆、细胞连接松弛时，加入含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化，吸管吹打使细胞脱离培养皿底，收集细胞悬液，1000r•min－1离心8min，按照12的比例接种于细胞培养皿及涂有多聚赖氨酸的细胞爬片上待测，每2d更换1次培养基，待细胞融合后，以同样方式继续传代。

1．2．3细胞形态学观察

倒置相差显微镜下观察各代LSC的爬出过程及生长状态，并将不同代数LSC固定(体积比为甲醇丙酮=11)，进行HE染色，显微镜下观察并拍照。

1．2．4LSC功能蛋白的表达

细胞免疫荧光检测:用固定液(体积比为甲醇丙酮=11)固定细胞爬片10min，将固定后的LSC爬片用PBS洗3次，然后用进口山羊血清封闭液封闭爬片30min，分别加入CK3(1100)、ABCG2(1100)、p63(150)、MUC5AC(1100)单克隆抗体，并以PBS代替一抗设阴性对照，4℃过夜孵育后分别加入IgG荧光二抗，室温孵育1h，DAPI复染细胞核，封片后激光共焦显微镜观察并照相，鉴定培养细胞CK3、p63、ABCG2及MUC5AC(1100)单克隆抗体的表达并拍照。

1．2．5流式细胞仪检测

将原代和传代后的LSC培养至形成单层，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，1000r•min－1离心8min后，制成细胞悬液，用牛血清孵育30min，1000r•min－1离心8min后，细胞计数，然后每106细胞加入ABCG2-FITC单克隆抗体10μL进行标记，孵育30min，每10min摇匀1次，PBS洗2次，过细胞筛，流式细胞检测仪检测LSCAB-CG2-FITC单克隆抗体在培养细胞中所占的比例，比较原代和传代后LSCABCG2-FITC单克隆抗体的含量变化。

1．2．6MTT比色法测细胞活性

将50mgMTT溶于10mLPBS中，用0．22μm滤膜过滤后配制新鲜MTT液。细胞达到对数生长期时，消化、离心细胞，按照每孔2000个细胞的密度接种于96孔板，分别设12h、24h、48h、72h共4个时间点，每个时间点设5个复孔。每个时间点分别加入5g•L－1MTT溶液20μL，CO2培养箱中继续孵育4h后小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，脱色摇床振荡10min，酶标仪测定各孔吸光度(A)值，参考波长为490nm。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制各代细胞的生长曲线图，比较原代和传代细胞的增殖活性。

2结果

2．1培养细胞形态学观察

角膜缘组织块在置于培养皿上2～3h后贴附良好。倒置相差显微镜下可见，24h后有细胞从组织块边缘个体迁移，贴壁生长，呈多边形，体积较小，48h后细胞局部可见拉网样生长趋势，72h后出现大片细胞，细胞呈现多边形或多角形，96h细胞几乎铺满整个培养板(图1)。显微镜下可见3种细胞形态:(1)圆形、卵圆形，类似基底的柱状细胞，核浆比大;(2)多边形，类似翼状细胞;(3)大而扁平状，类似表层上皮细胞。细胞以卵圆形或多边形为主，多为2～3个核仁，部分可见丝状骨架结构。显微镜下可见，原代细胞生长状态良好，细胞以多边形及卵圆形为主，可见双核细胞、多核细胞及核分裂相，细胞间连接紧密;传代后第1代细胞呈规则多边形，可见双核细胞，细胞间连接紧密，类似上皮样细胞，可见少量纤维细胞;第2代细胞形态呈不规则状，几乎无双核细胞，无细胞间连接，完全失去上皮细胞的特性(图2)。

2．2培养细胞免疫荧光染色和检测结果

2．2．1细胞免疫荧光染色

经鉴定，培养的细胞CK3、ABCG2、p63单克隆抗体染色均呈阳性，MUC5AC单克隆抗体染色呈阴性，证明为LSC细胞(图3)。原代LSCCK3单克隆抗体间接免疫荧光染色多数细胞不着色，少数细胞着色，细胞质呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光;第1代LSCCK3染色阳性细胞较原代细胞增多，第2代LSCCK3染色阳性细胞进一步增多。原代LSCp63单克隆抗体表达有很高的阳性率，圆形及卵圆形细胞的细胞核均呈红色荧光;第1代LSCp63的表达与原代细胞无明显差异，第2代LSCp63的表达明显下降(图3-4)。

2．2．2流式细胞仪检测

流式细胞仪检测结果显示，原代、第1代和第2代LSCABCG2单克隆抗体阳性率分别为13．41%、22．96%和4．43%。2．3细胞增殖活性检测传代后细胞与原代细胞比较生长曲线有明显的下降，而且原代细胞有明显的细胞增长期，但第1代细胞生长曲线对数增长期不明显，第2代细胞几乎无增长期。各代细胞增殖活性差别显著(图5)。

3讨论

3．1LSC的培养

目前，LSC的培养方法主要有酶消化培养法和组织块培养法［11］，其中，组织块培养法应用最为广泛。Short等［12］通过比较酶消化培养法和组织块培养法表明，组织块培养法培养的细胞能更好地保持细胞原有形态，具有更多的桥粒连接和更紧密的细胞连接，能更好的保持角膜上皮细胞的功能。有文献报道，组织块培养法培养的LSC并不是单一的细胞，而是混合细胞，细胞包含一定量的LSC、短暂扩充细胞、分化的角膜上皮细胞及少量纤维细胞。在本实验中，利用组织块培养法体外培养兔角膜缘上皮组织，培养4d左右可达到80%～90%的融合状态，说明培养的角膜缘上皮细胞具有较强的分裂增殖能力;另外，形态学上细胞具有体积小，圆形或卵圆形，可见双核细胞、多核细胞及核分裂相，细胞间连接紧密等原始细胞生物学特性，说明组织块培养法培养的LSC具备作为LSC移植的种子细胞的特点。

3．2LSC的鉴定

现阶段国内外对LSC的基础研究仍然很薄弱，尤其是在LSC的标记物方面，迄今为止尚未找到一种LSC特异性表达分子标记物［1，6，13-14］，因此，只能选择几种目前比较确切的标记物组合如ABCG2、p63、CK3来鉴定LSC;在LSC中ABCG2、p63表达呈阳性，而CK3表达为阴性。AB-CG2蛋白在细胞膜和细胞浆内表达，阳性表达细胞分布于角膜缘上皮基底层的小细胞簇，其增生能力显著高于阴性细胞，最符合角膜上皮干细胞的特征。p63为一种白，表达于全角膜的基底层和基底细胞上层，其阳性表达是角膜缘强增殖能力细胞的标志［1，6，13-16］。CK3是一组非水溶性细胞骨架蛋白，在角膜上皮细胞特异地表达，被认为是角膜上皮分化细胞的标记物;然而CK3角膜基底层细胞不表达，呈现未分化的自然状态，为LSC鉴定的阴性标志物。MUC5AC是结膜细胞特异性表达标记物。本研究免疫荧光染色结果显示，培养的细胞CK3、ABCG2、p63抗体均呈阳性表达，而MUC5AC单克隆抗体为阴性表达，说明培养的细胞为角膜分化上皮细胞、LSC和短暂扩充细胞的混合细胞，且无结膜细胞的污染。本研究结果显示，p63在大部分原代细胞中表达阳性，第1代细胞p63表达与原代细胞比较无明显差异，而第2代细胞p63表达明显下降;CK3仅在少量原代细胞中表达，随着传代次数增加CK3表达阳性率逐渐增加。综合分析后表明，原代和第1代细胞能较好地保持LSC特性，可作为临床角膜缘上皮细胞移植的种子细胞。

3．3LSC含量的测定

单细胞生物的特点篇5

细胞增殖在高中生物学习中占有重要地位，它是生物的生长、发育、繁殖和遗传的基础，它还涉及细胞的结构和功能、细胞分化以及新陈代谢等相关内容。真核细胞的增殖方式包括有丝分裂、无丝分裂和减数分裂三种方式，特别是有丝分裂和减数分裂是高中生物学习中最难理解的部分之一，而这些生命现象又是看不见摸不着的，对于学生来说是比较抽象的，所以学生在学习时常会陷入一些认识误区。我个人结合这几年的教学经验及参考相关资料，特总结出在高中生物学习中学生对细胞增殖的认识容易出现的几个误区。

一、在细胞分裂间期染色体经过复制后，染色体和DNA的数目都增加一倍

辨析：在细胞分裂间期，用光学显微镜观察细胞核内的染色体，它似乎是静止的，实际上细胞核内部正在完成组成染色体的DNA分子的复制和有关蛋白质的合成。染色体复制的结果是每个染色体都形成了两个完全一样的姐妹染色单体，但由一个共同的着丝点连接着，每个染色体只含有一个着丝点，计算染色体的数目时，以着丝点为单位。所以在细胞分裂间期染色体复制的结果是DNA数量加倍，而染色体数目不变。需要重点强调的是染色体数目加倍发生在细胞分裂的后期，着丝点一分为二时，由一个着丝点相连的两条姐妹染色单体彼此分离后形成了两条子染色体。

二、在细胞分裂前期出现的纺锤丝都附着在染色体上

辨析：纺锤丝是细胞在分裂前期出现的丝状结构，从细胞两极发出后形成一个梭行的纺锤体。在细胞内的纺锤丝有两种类型：一类丝一端与染色体的着丝点相连，另一端向极的方向延伸，称为染色体牵丝。另一类丝并不与染色体相连，而是从一极直接延伸到另一极，称为连续丝。染色体是在染色体牵丝的牵引下，向着细胞的两极移动。

三、赤道板和细胞板都是细胞分裂中真实存在的物质结构

辨析：在细胞分裂中期，每条染色体的着丝点的两侧，都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体运动，使每条染色体的着丝点排列在细胞中央的一个平面上，这个平面与纺锤体的中轴相垂直，类似于地球上赤道的位置，所以叫赤道板。赤道板只是类似地球赤道位置的空间，此板是不存在的，是非物质的，是人们在研究细胞分裂时假象的一个平面。相反，细胞板是细胞在分裂末期在赤道板的位置形成的真实存在的结构，最后会发展成细胞壁在光学显微镜下能够看见。

四、细胞在分裂后期，着丝点的分开是纺锤丝牵拉所致

辨析：在细胞分裂后期，着丝点一分为二，两条姐妹染色单体分开后成为两条染色体，纺锤丝把两条染色体拉向细胞两极。但是着丝点的分裂并非纺锤丝牵拉所致。从染色体的结构可见，染色体上的主缢痕部位是着丝粒，它的两侧为着丝点，这是染色体上不可缺少的部分。着丝粒是指有丝分裂过程中姐妹染色单体在前期时连接，后期时分离的一段非编码DNA区域。在分裂前期和中期，着丝粒把两个姐妹染色单体连在一起，到后期产生两个着丝粒，随后姐妹染色单体分开。而着丝点位于着丝粒两侧，各由一个蛋白质构成的三层盘状或球状结构，与纺锤体的纺锤丝连接，与染色体的移动有关。所以着丝点的分开并非由纺锤丝的牵拉所致，即使没有纺锤丝存在时，着丝点也可以一分为二。

五、减数第二次分裂整个过程中，染色体的变化特点与有丝分裂完全相同，它完全是一次普通的有丝分裂

辨析：有丝分裂的重要特点之一，是一条染色体上的两条姐妹染色单体在后期分离后形成两条子染色体分别进入不同的子细胞，在这一点上，减数第二次分裂的结果与有丝分裂是相同的。但是，对于二倍体生物来说，有丝分裂产生的子细胞内有成对的同源染色体，而减数第一次分裂之后，由于同源染色体彼此分离，成对的同源染色体就分别进入不同的子细胞中，所以次级精（卵）母细胞中不存在成对的同源染色体。因此，在减数第二次分裂过程中和产生的精（卵）细胞中是没有成对的同源染色体的，所以减数第二次分裂绝不是一次普通的有丝分裂，只能说类似于普通的有丝分裂。

六、生殖细胞的产生必须通过减数分裂

辨析：生殖细胞是指生物借以繁殖下一代的细胞，如、卵细胞、孢子等。进行有性生殖的生物，产生生殖细胞时，大多是经过减数分裂；但也有例外的，如高等植物的、卵细胞的最后形成都是有丝分裂，还有进行无性生殖的生物，如根霉、青霉等，它们产生的孢子也属于生殖细胞的一种，但无性别之分，叫无性生殖细胞，是通过有丝分裂产生的，不需经过两性生殖细胞的结合就可直接形成新个体。可见，生物的生殖细胞有通过减数分裂产生的，也有通过有丝分裂产生的

七、有丝分裂产生的体细胞中染色体都是以成对的同源染色体存在，而减数分裂产生的生殖细胞中的染色体都是以非同源染色体存在

辨析：在一般情况下（对于二倍体生物来说），有丝分裂产生的体细胞中染色体都是以成对的同源染色体存在，而减数分裂产生的生殖细胞中的染色体都是以非同源染色体存在。但也有例外的，如蜜蜂、蚂蚁等，它们的雄性个体（雄蜂、雄蚁）都是由未受精的卵细胞发育而来，通过孤雌生殖产生的单倍体生物，其细胞中无同源染色体存在，所以，它们有丝分裂产生的体细胞中也无同源染色体存在。而多倍体生物同源的染色体就有多个，如马铃薯是同源四倍体，体细胞中同源染色体就有四个，经过减数分裂形成的生殖细胞中也有同源染色体存在。

八、原核细胞进行的分裂就是无丝分裂

单细胞生物的特点篇6

1单细胞分离

单细胞分离的方法很多，包括显微操作技术（micromanipulation）、激光捕获显微切割技术（lasercapturemicrodissection,LCM）、微流控技术（microfluidicplatforms）等。目前在法医DNA检验中实际应用的技术平台有两种，显微操作技术和激光捕获显微切割技术。

1.1细胞染色由于在实际案件中获得的细胞，细胞形态并不是实验室理想的形态，为了更好的识别细胞，在普通显微镜下观察时需要对细胞进行染色。对于上皮细胞，我们研究组尝试了不同的染色方法，通过联用显微操作技术对龙胆紫浓度梯度及时间梯度染色进行研究发现，0.5μL龙胆紫染液（0.05g/mL）加入100μL细胞悬液，5min后胞核着色即已明显，能有效提高显微捕获单细胞分离检验技术的检测效能，另外，染色时间不影响DNA结果分析[7]。对于细胞染色，DiMartino等通过对比核固红与巴氏染色法，证实巴氏染色法不仅能清晰的观察细胞，而且不影响下游PCR扩增[8]。Sanders等通过大量的实验发现，苏木素/伊红染色法（H&E）染色后的细胞STR分型峰高下降幅度较小，不影响分型结果[9]。也可以用荧光原位杂交技术对细胞的性染色体进行标记。

1.2显微操作技术显微操作技术是在显微镜下通过微毛细管吸取单个细胞。典型的显微控制系统包含一个倒置显微镜加上一个操纵杆操作，电动精密控制平台。其优点是操作容易进行，通过显微镜直观地分离单个细胞，成本低，主要用于较小细胞群体中的目标细胞分离。该平台适合对案件中上皮细胞进行分离，3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完整分型，甚至低至一个细胞也可得到完整分型，该方法已成功应用于一起案的检验。在该案件中，提取受害人皮肤上的唾液斑，通过在镜下分离有核的口腔上皮细胞（来自于犯罪嫌疑人）和无核角化的上皮细胞或细胞碎片（来自于受害者皮肤），成功获得嫌疑人的STR分型。在案件中常碰到的血烟头检材，由于血液量大，常规方法很难获得烟头上唾液来源个体的STR分型，即使用单细胞分离检验时，也常常获得混合STR分型。本课题组在显微操作标准流程的基础上进行改进，将吸取的细胞先在TNE缓冲液中清洗几次，以彻底去除血液细胞碎片和游离DNA，最终获得完整唾液来源个体的DNA分型。也有报道将显微操作分离的方法用于分离，但细胞体积非常小，直径只有约6μm，毛细管吸取操作相对困难，下面介绍的激光捕获显微切割技术平台更加适合细胞的分离操作。显微操作法存在以下几个方面的不足。第一，由于依赖手工操作，对实验员的经验与操作能力要求较高，自动化程度较低，而且玻璃吸针脆性大，操作时易碎。第二，耗时较长，操作繁琐。第三，对于涂片后的检材，必须在液体环境下进行操作，容易受蒸发的影响，检材蒸干后，再补水时容易造成检材的损失，甚至带来污染。第四，对于案件中陈旧样本，根据形态识别细胞容易出错。

1.3激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术是利用UV（320~400nm）激光切割并捕获涂于覆膜玻片上的细胞。仪器设备较昂贵，自动化程度较显微操作技术平台高，是目前法医学应用最有效的单细胞分离方法，可用于上皮细胞、细胞、白细胞等不同类型的细胞分离。目前，该平台应用较多的是案中差异裂解法无法消除女性成分干扰的精斑检材，通过在显微镜下寻找并捕获细胞以消除女性成分。由于细胞是单倍体，理论计算证明捕获15~20个未降解的细胞，有很高的可能性获得完整的STR分型，实验证明至少捕获30个细胞可获得完整的STR分型。也有学者应用悬液荧光原位杂交（suspensionfluorescenceinsituhybridization，S-FISH）对案样本进行标记，通过这种方法可以明显减少前处理操作步骤。对于多个贡献者的混合精斑，差异裂解法不能将每个贡献者完全分离。近年来，我们研究组在这方面有深入的研究。通过联合使用激光捕获显微切割方法和低体积扩增技术，可以实现以单个细胞DNA为模板，进行Y-STR扩增检测，并成功获得三人混合精斑中各个来源人的Y-STR分型。研究组进一步使用荧光原位杂交技术标记Y型，特异性挑选Y型，通过优化组合Y-STR基因座与10个常染色体STR基因座（auto-STR），构建全新的YA-STR复合系统。其中，Y-STR基因座用于区分不同个体，通过组合Y-STR相同的图谱，实现个体的常染色体STR分型检验。首次尝试将该技术应用于三人混合精斑的检验，准确地获得了三个个体的STR分型。近年来，我们研究组还利用该平台建立了男女混合血液样本的分离检验技术方法。该平台在寻找细胞这一步骤时耗时耗力。有研究组开发了自动化的图像识别软件，通过分析图像中的光强、颜色和形状，可实现快速识别细胞，但是对不同种类细胞准确快速的识别仍需要进一步的研究。

1.4微流控技术最近兴起的微流控技术平台因其高通量、自动化、可有效防止污染而备受关注。微流控装置封闭的操作空间可以有效地避免污染，微升至纳升的操作体积可以保证较高的样品浓度，同时减少试剂消耗，虽然目前还没有在法医学单细胞分离中实际应用，但未来有很大的发展潜力。

2单细胞裂解

分离得到单细胞后，需将细胞裂解获得基因组DNA。传统的法医DNA检测需要对基因组DNA进行纯化，而对于单细胞检验，为了避免DNA的损失，常略去纯化步骤，裂解后直接进行PCR扩增。因此，裂解步骤要保证不影响后续PCR扩增反应的顺利进行。目前主要使用蛋白酶裂解，常用蛋白酶K或Protease（德国QIAGEN公司），酶解后高温使胞内蛋白质及蛋白酶K变性失活，利于基因组DNA的释放和下游PCR反应。对于细胞可加入DTT，打断二硫键，使细胞充分裂解。

3PCR扩增

一个细胞中的总DNA量仅有数匹克，常规的PCR管扩增需要的细胞数目较多，我们的研究结果显示至少20个口腔上皮细胞或60个细胞检测到Identifiler®PCR试剂盒（美国ABI公司）中全部分型。最近几年发展起来的微量化反应，即芯片-低体积PCR扩增（on-chiplowvolume-polymerasechainreaction，LV-PCR）系统[23,24]，在低至1.5μL的PCR体系中，DNA模板与引物和聚合酶结合的机会明显提高，使微量细胞甚至单个细胞进行DNA分型变为现实，不仅检测的灵敏度得到提高，而且检验范围也大大拓宽了。LV-PCR使用贝克曼公司的AG480FAmpliGridslide进行扩增，前期大量的研究都是使用该产品进行，而且实验证明该产品灵敏度、准确性可满足法医单细胞检验的要求。另外一种最新的方法也值得关注，是在微液滴里进行PCR扩增。首先将单个细胞和荧光标记引物结合的微珠随机扩散在1.5nL的油包裹的琼脂微流液滴中，在大量微液滴内进行平行的PCR扩增反应后，于PCR扩增管内进行二次扩增，常规毛细管电泳检测，通过对大量单个细胞进行平行9重STR检测，获得混合样本各成分的STR分型。

4数据分析

单细胞检验由于DNA模板量非常低，其缺带、多带等现象经常发生，stutter峰较常规扩增强，单细胞检验的数据分析和低拷贝DNA的分析方法类似，需平行扩增，综合多次结果获得最终的STR分型。一般来说至少需获得5次有效分型（获得13个基因座以上的结果）[28]，重复3次及以上的位点才能确认为有效位点。

5单细胞测序

在二代测序技术和全基因组扩增技术（wholegenomeamplification,WGA）发展的基础上，2011年，Navin等人首次发明了单细胞测序（single-cellsequencing,SCS）技术，测定了人体单个细胞的基因组DNA。单细胞测序的文章呈逐年递增状态，从2011～2014年，由5篇文章上升至近30篇，涉及生物学多个领域，发表于生物学顶级期刊上。2013年《，科学》杂志将单细胞测序列为年度领域榜首《，自然方法》杂志将单细胞测序列为2013年年度最重要的方法学进展。

5.1全基因组扩增技术由于单个细胞DNA含量有限，需进行全基因组扩增才能满足二代测序的最低DNA量。目前，已有多种以单个基因组为模板的全基因扩增技术，简称寡核苷酸引物PCR技术（degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR）和多重置换扩增技术（multipledisplacementamplification,MDA）。其中DOP-PCR方法覆盖率低，但可获得准确的拷贝数。MDA方法是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。Phi29DNA聚合酶具有3’5’外切酶活性，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性，产生的DN段较大，约为50~100kb，可以覆盖基因组的90%以上，和DOP-PCR方法一样也会产生不同区域扩增不平衡性，MDA方法产生的不平衡性不具有重复性。2012年，首次报道了基于多次退火环状循环的扩增技术（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC），该方法结合MDA扩增技术和PCR扩增技术的优势，利用特殊设计的引物，巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环，进而在一定程度上防止了基因组DNA的指数性扩增，明显降低了扩增偏倚性，并显著提高覆盖度，但是该方法使用Bst聚合酶，没有校错活性（proofreadingactivity）。现有的商业化试剂盒各项参数见表1。全基因组扩增技术虽然仍然会有基因缺失等问题，但是相信随着时间的推移和技术的进步，扩增的准确性会逐步提高。

5.2二代测序技术对单细胞全基因组扩增后进行二代测序。二代测序技术具有快速、高效、低成本的优点。近两年来的研究表明，二代测序结果的准确性很高，与传统的Sanger测序相当。二代测序技术在法医学中应用研究很多，目前已经有两种商业化的试剂盒，美国ThermoFisherScientific公司开发的基于SNP的theHID-IonAmpliSeqTMIdentityPanel和theHID-IonAmpliSeqTMAncestryPanel，主要通过SNP检测进行个体识别和祖先推断；美国Illumina公司开发的ForenSeqTMDNASignaturePrepKit，在一个PCR反应中可以同时扩增27个常染色体STR，8个X-STR，25个Y-STR，95个个体识别SNPs，56个祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,AIMs)和24个显性特征SNPs，更适合法医学应用。这两个公司使用的测序技术的优缺点见表2。

6单细胞检验展望